嗜水氣單胞菌外膜蛋白原核表達及其免疫保護性研究

劉 望， 楊佳杰， 楊 靜， 薛 茜， 張 苗， 劉 歡

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

嗜水氣單胞菌外膜蛋白原核表達及其免疫保護性研究

劉 望， 楊佳杰， 楊 靜， 薛 茜， 張 苗， 劉 歡*

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

嗜水氣單胞菌是我國水產養殖魚類重要病原菌，抗生素防治易產生耐藥性等問題，亟需開發新型防治手段.外膜蛋白OmpA和OmpTS是嗜水氣單胞菌主要的免疫原蛋白，為了得到免疫效果更佳的亞單位疫苗，利用大腸桿菌將OmpA和OmpTS進行融合表達，并對表達產物進行純化，檢測其對斑馬魚的免疫保護效果.結果表明：成功擴增獲得大小分別為1 032 bp和1 068 bp的OmpA和OmpTS基因序列，隨后進行Overlap PCR，得到大小為2 100 bp的融合片段OmpA-OmpTS.成功構建重組表達質粒 pET28a-OmpA-OmpTS，將其轉入BL21 ( DE3)，重組蛋白的表達條件為：菌體培養2 h后添加IPTG 1 mM,16 ℃下培養16 h.經純化后得到重組蛋白OmpA-OmpTS; 最后將OmpA-OmpTS蛋白與弗氏不完全佐劑(FIA) 混合免疫斑馬魚，免疫保護率可達82.1%,表明該融合蛋白可作為候選亞單位疫苗進行進一步的開發.

嗜水氣單胞菌; 外膜蛋白; 原核表達; 免疫保護性

0 引言

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是一種條件致病菌，主要存在于海水、淡水、河流、湖泊等水環境以及污泥、土壤、人類糞便中，是我國水產養殖魚類爆發性傳染病的主要病原[1]，可以感染草魚、鯉魚、鯽魚以及羅非魚等多種水產養殖魚類，此外，嗜水氣單胞菌還可以感染人和動物等[2]，能引發人類的中耳炎、敗血癥及創傷面感染、腹膜炎以及急性腸胃炎等疾病[3，4].

近年來，世界各地均陸續報道從食品、醫療用品以及急性胃腸炎患者糞便中檢測出嗜水氣單胞菌[5,6]，在國外，嗜水氣單胞菌已經被列入食品衛生檢驗的對象和醫院腹痛腹瀉病原菌檢測的一項內容.因此，嗜水氣單胞菌相關疾病的爆發不僅給水產養殖業造成巨大損失，還直接對人類健康造成了威脅，受到水產、獸醫學界的重視[7].

目前，防治該病的主要方法仍是使用抗生素，但是隨著抗生素的反復使用，細菌產生耐藥性，抗菌治療的效果不明顯，導致患病魚的平均死亡率達40%～50%，給水產養殖業造成了嚴重的經濟損失.因此，尋找免疫保護性抗原是預防該病暴發的重要手段.

國內外學者已對嗜水氣單胞菌進行了系統研究，發現嗜水氣單胞菌可產生多種毒力因子，得到認可的毒力因子包括外毒素、胞外蛋白酶、脂多糖、外膜蛋白等.外膜蛋白(Outer membrane proteins，Omps)是存在于細菌外膜中所有蛋白的總稱，在維持外膜結構、保證物質運輸等方面有著重要作用[8].同時，由于其位于細胞的最外面而在細菌適應環境變化及致病性過程中亦扮演著重要角色.當細菌進入一個新的環境時，其外膜蛋白的合成會跟著變化[9].有許多研究結果表明，細菌的主要外膜蛋白的免疫原性很強，是重要的保護性抗原，利用致病菌的 OMP 做免疫原還可使魚產生對不同血清型菌株感染的交叉保護力[10-12].

本研究選取嗜水氣單胞菌外膜蛋白ompA 基因和ompTS 基因在大腸桿菌中進行融合共表達，分離和純化，并與弗氏不完全佐劑(Freud′s incomplete adjuvant,FIA) 結合，考察其對斑馬魚的免疫保護效果，旨在為研制嗜水氣單胞菌基因工程奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、嗜水氣單胞菌LS01、表達質粒pET28a均由本實驗時保存.pMD19T購自TaKaRa公司.

1.1.2 主要試劑和儀器

(1)主要試劑：LB培養基，購自上海生工生物工程有限公司；Taq DNA聚合酶、Pfu高保真聚合酶、蛋白質分子標準量Marker、DNA分子標準量Marker、DNA回收試劑盒及質粒抽提試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；T4DNA連接酶及限制性內切酶，購自TaKaRa公司.

(2)主要儀器：恒溫培養箱，LRH-250,上海一恒科學儀器有限公司；搖床,THZ-C-1,太倉市儀器設備廠；PCR儀,MyCycler thermal cycler;核酸電泳儀,power PacTMHC,伯樂生命醫學產品有限公司；凝膠成像系統,FR980,上海復日科技有限公司.

1.1.3 引物

表1為本研究中使用的引物，參照GenBank上公布的基因序列設計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成.下劃線為限制性內切酶識別位點.

表1 實驗中所使用的引物

1.2 方法

1.2.1 ompA和ompTS基因的克隆及ompA-ompTS融合基因的構建

將-80 ℃保存的嗜水氣單胞菌接種于LB液體培養基，30 ℃ 恒溫培養24 h，取1 mL 培養菌液按照天根細菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA,以其為模板，分別利用引物對AF/AR和TSF/TSR進行基因擴增，分別克隆獲得ompA和ompTS基因.PCR反應體系為 50μL: 2×Taq Master Mix 25μL，DNA 模板 3μL，上下游引物各3μL，補加 dd H2O 至 50μL.反應條件:94 ℃ 預變性4 min，94 ℃ 50 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30 個循環，最后 72 ℃延伸 7 min.反應產物以1% 瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統檢測擴增結果.隨后以回收到的ompA和ompTS基因序列為模板，以引物對AF/TSR進行Overlap PCR，反應條件除延伸時間增加至2 min 鐘外，其他條件同上.產物檢驗后割膠回收并用試劑盒純化，最后以物質的量之比3∶1(插入片段/載體) 的比例克隆入pMD19-T 載體，轉化大腸桿菌DH5α，在含氨芐青霉素( 100μg/mL) 的LB 平板上挑取含有重組質粒pMD19T-ompA-ompTS的陽性克隆，利用T載體通用引物M13進行菌落 PCR鑒定后進行基因測序.

1.2.2 重組表達質粒pET28a-ompA-ompTS的構建

分別對重組質粒pMD19T-ompA-ompTS和表達質粒pET28a進行質粒提取，并根據引物中設計的酶切位點，分別利用SalI和XhoI對所抽提的質粒進行雙酶切消化，瓊脂糖凝膠電泳分析并將酶切后的融合基因ompA-ompTS與表達質粒pET28a進行連接，轉化大腸桿菌BL21( DE3)，在含卡那霉素( 100μg/mL) 的LB 平板上挑取含有重組質粒pET28a-ompA-ompTS的陽性克隆，利用pET系列載體T7通用引物進行菌落 PCR鑒定后進行基因測序.

1.2.3 重組表達載體pET28a-ompA-ompTS在大腸桿菌中的表達和純化

將構建好的含有重組表達質粒pET28a-ompA-ompTS的大腸桿菌BL21置于添加卡那霉素的LB培養基中過夜活化培養.次日按照體積比1∶100 加入到 1 mL同樣的培養液中，37 ℃振蕩培養.當菌種OD600達到0.6～0.8時，加入IPTG，不同溫度下進行誘導表達，隨后收集菌體進行SDS-PAGE分析.將誘導表達后以包涵體形式存在的融合蛋白進行超聲破碎，沉淀用含2 mol/L尿素的包涵體洗滌液洗滌，洗滌后離心倒去上清，重復3次；再用含6 mol/L鹽酸胍緩沖液溶解重組蛋白，將溶解后的溶液用0.45μm孔徑的濾膜過濾，過濾后的溶液經 Ni柱親和純化，純化的蛋白于4 ℃進行梯度尿素復性透析至PBS，復性產物經SDS-PAGE進行檢測.

1.2.4 重組融合蛋白與弗氏不完全佐劑混合乳化

將純化后的OmpA-OmpTS融合蛋白用PBS重懸，將其濃度調整至2 mg/mL，然后與弗氏不完全佐劑FIA按照1∶1的比例混合，在10 mL無菌注射器中進行乳化.乳化時先用移液器乳化5 min，然后用注射器反復推進，直至水相與油相完全融到一起，形成油包水的乳白色液滴.取一滴滴入水中，如果液滴不擴散則說明乳化完全，若擴散則需繼續乳化.將乳化好的樣品放4 ℃冰箱保存備用.

1.2.5 免疫

將健康斑馬魚隨機分成4 組，其中2個組為免疫組(OmpA-OmpTS+FIA、OmpA-OmpTS)，2個組為對照組 (FIA、PBS)，每組20條，平行設置3組.亞單位疫苗OmpA-OmpTS免疫劑量為 2μg/g 魚，與佐劑按照 1∶1 進行混合，每尾魚背部肌肉注射配比好的佐劑疫苗，對照組注射等量的FIA或PBS.2 周后免疫組用等量的亞單位疫苗加強免疫一次(不包含佐劑).

1.2.6 攻毒試驗

將嗜水氣單胞菌LS01菌株接種于新鮮培養基中，于30 ℃過夜培養.以 7.5×107CFU/mL為攻毒濃度，每尾背部肌肉注射0.2 mL，攻毒后連續觀察7 d，記錄死亡情況.以相對保護率表示免疫效果: 相對保護率(RPS) = [1-( 免疫組死亡率/對照組死亡率)]×100% .

2 結果與討論

2.1 ompA和ompTS基因的克隆與鑒定

以嗜水氣單胞菌LS01基因組DNA為模板，用設計的引物對AF/AR和TSF/TSR分別進行PCR擴增，通過凝膠電泳分析發現，成功獲得大小分別為1 032 bp和1 068 bp的ompA和ompTS基因片段(如圖1所示).PCR產物純化后構建T-A克隆進行測序，在 NCBI上進行序列比對分析，確定二者分別為嗜水氣單胞菌OmpA和OmpTS蛋白編碼基因的開放閱讀框編碼序列區，其編碼的蛋白質分別包含345個和356個氨基酸殘基.

圖1 ompA和ompTS基因克隆PCR電泳圖

2.2 序列同源性分析

新鮮的黃牛肉呈棕色或暗紅，剖面有光澤，結締組織為白色，脂肪為黃色，肌肉間無脂肪雜質；新鮮的綿羊肉，肉質較堅實，顏色紅潤，纖維組織較細，略有些脂肪夾雜其間，膻味較重；新鮮的山羊肉，肉色比綿羊的肉質厚、略白，皮下脂肪和肌肉間脂肪少，膻味較輕。

在對OmpA和OmpTS蛋白編碼基因進行測序后，將兩個基因編碼的氨基酸序列分別與NCBI數據庫中已登錄的嗜水氣單胞菌及其他氣單胞菌屬氨基酸序列進行比對分析:結果發現嗜水氣單胞菌LS01的OmpA基因和OmpTS基因編碼的蛋白與嗜水氣單胞菌ATCC7966外膜蛋白OmpA和OmpTS的同源性為99% ，表明嗜水氣單胞菌OmpA和OmpTS高度保守.同時，OmpTS與其他氣單胞菌屬(溫和氣單胞菌，豚鼠氣單胞菌)中的OmpTS亦具有較高的保守性，同源度均達到82%以上.而OmpA與其它氣單胞菌屬中的OmpTS氨基酸組成的同源性亦可達到65%以上(如圖2、圖3所示).可見，OmpA和OmpTS不止在嗜水氣單胞菌中具有較高的保守性，且在氣單胞菌屬中亦具有較高的保守性，因此，以這兩種蛋白構建的亞單位疫苗可能對多種氣單胞菌屬的病原菌實現多效價的免疫保護作用.

圖2 OmpA氨基酸序列同源性比對分析

圖3 OmpTS氨基酸序列同源性比對分析

2.3 融合基因ompA-ompTS的克隆

在成功克隆得到了嗜水氣單胞菌LS01中外膜蛋白OmpA和OmpTS編碼基因后，進一步地，通過Overlap PCR將OmpA和OmpTS編碼基因進行融合連接.結果顯示，以OmpA和OmpTS編碼基因為模板，利用引物對AF/TSR成功擴增得到大小為2 100 bp的特異性DNA片段(如圖4所示)，對產物進行回收和測序后證實其為融合基因ompA-ompTS.

圖4 ompA-ompTS融合基因 Overlap PCR電泳圖

2.4 重組表達質粒pET28a-OmpA-OmpTS的構建及鑒定

克隆得到融合基因ompA-ompTS后，通過限制性內切酶消化后與表達質粒pET28a進行重組連接，并轉化至宿主大腸桿菌BL21(DE3)中，于含有卡那霉素的抗性平板上培養，挑選克隆子，并利用pET28a表達載體通用引物進行菌落PCR驗證，結果如圖5所示.可以看到，挑選的7個克隆中有6個擴增得到大小為2 300 bp左右(即融合片段與通用引物在表達載體自身克隆片段之和)的特異性片段，即為陽性克隆，對其進行保種并進行測序分析，測序結果顯示陽性克隆株中含有成功連接了融合片段ompA-ompT的重組表達質粒.

2.5 OmpA-OmpTS融合蛋白誘導表達分析

將pET28a-OmpA-OmpTS質粒轉化大腸桿菌BL21( DE3) 得到 BL21/pET28a-OmpA-OmpTS重組菌，隨后對其重組蛋白的表達條件進行了優化.結果發現重組表達菌株在培養2 h后添加IPTG 1 mM,16 ℃下培養16 h經誘導后，與未經誘導重組菌全蛋白電泳條帶相比，在相對分子質量約80 kDa 處有一條表達量較高的蛋白條帶，大小與OmpA-OmpTS融合蛋白相符，說明OmpA-OmpTS融合蛋白成功表達(如圖6所示).

MW：蛋白質分子量標準；1：IPTG誘導后的pET28a/BL21；2：誘導16 h后的pET28a-ompA-ompTS/BL21；3：誘導前的 pET28a-ompA-ompTS/BL21 重組質粒

為了進行后續的免疫保護效果的測定，首先需要對重組表達蛋白進行分離純化.將誘導表達后以包涵體形式存在的融合蛋白進行超聲破碎，沉淀經洗滌后用鹽酸胍緩沖液溶解重組蛋白，經 Ni柱親和純化的蛋白進行梯度尿素復性，隨后SDS-PAGE 進行檢測.結果顯示，純化后可獲得大小約為80 kDa的目的蛋白(如圖7所示).

圖7 OmpA-OmpTS融合蛋白的純化

2.7 融合蛋白OmpA-OmpTS免疫保護性分析

圖8 嗜水氣單胞菌攻毒斑馬魚累計死亡率

在利用純化后的融合蛋白OmpA-OmpTS、混合FIA佐劑的融合蛋白以及對照分別對斑馬魚進行免疫后，用嗜水氣單胞菌LS01進行魚體攻毒實驗.試驗魚攻毒后第1天便出現死亡，第2天開始，FIA和PBS對照組出現大量死亡的情況，而免疫組OmpA-OmpTS及OmpA-OmpTS+FIA組斑馬魚的死亡情況則明顯減少(如圖8所示) .PBS、FIA、OmpA-OmpTS和OmpA-OmpTS+FIA組連續觀察7 d的累計死亡率分別為100%、93.33%、31.7%和16.7%.OmpA-OmpTS和OmpA-OmpTS+FIA組對于斑馬魚在抵抗嗜水氣單胞菌攻毒時的相對保護率分別為68.3%和82.1%.可見，經融合蛋白OmpA-OmpTS免疫后的斑馬魚可以較好地抵制嗜水氣單胞菌的侵染，具有較好的免疫保護效果.

3 結論

嗜水氣單胞菌是水產養殖，尤其是淡水魚類一種重要的條件致病菌，每年因其感染所引起的病害給我國水產養殖業造成了巨大的經濟損失.傳統的抗生素防治手段因易造成耐藥性和藥物殘留等問題已被國家禁止在水產養殖過程中使用. 疫苗由于具有較好的免疫活性和環境友好等優點已成為目前病害防治領域研究的熱點.很多研究表明,外膜蛋白具有良好的免疫原性,是研制基因工程疫苗的良好材料[13-15].

本研究選取pET28a作為表達載體，將通過Overlap PCR進行融合的兩個外膜蛋白OmpA和OmpTS進行重組表達.成功獲得可高效表達融合蛋白的重組表達質粒，通過對融合蛋白分離和純化后獲得融合蛋白OmpA-OmpTS，并對其進行斑馬魚免疫保護性實驗，結果發現該融合蛋白OmpA-OmpTS在不添加佐劑時對斑馬魚的免疫保護率達到68.3%，與FIA佐劑混合后免疫保護率可達82.1%，可較好地抵御嗜水氣單胞菌病害的發生.

本研究為嗜水氣單胞菌亞單位疫苗的設計與開發奠定了一定的理論基礎.但鑒于嗜水氣單胞菌不同分離菌株間的毒力和致病性差異較大，該融合蛋白對斑馬魚的免疫保護效果只進行了針對LS01菌株攻毒的檢測，而對于其它嗜水氣單胞菌菌株的保護效果則需進一步的實驗分析.同時，本研究只進行了兩個外膜蛋白的融合表達，后續可進一步地篩選嗜水氣單胞菌其它具有較高免疫原性的蛋白進行亞單位疫苗的構建，以期得到免疫效果更佳優良的疫苗.

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【責任編輯：陳佳】

TheprokaryoticexpressionandimmunoprotectionanalysisofoutermembraneproteinsofAeromonashydrophila

LIU Wang, YANG Jia-jie, YANG Jing, XUE Qian, ZHANG Miao, LIU Huan*

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science amp; Technology, Xi′an 710021, China)

Aeromonashydrophilais one of the important fish pathogen in China,and antibiotics treatment for this disease can cause the drug-resistance. Therefore,it′s an urgent need for developing new prevention methods now.In order to obtain the subunit vaccine with better immunoprotective effect,the two outer membrane proteins,OmpA and OmpTS were fusion expressed inEscherchiacoliand the products were purified and its protective efficiency on the zebra fish againstAeromonashydrophilawere tested.The results showed that the ompA (1 032 bp) and ompTS (1 068 bp) genes were successfully cloned and the fusion fragment,OmpA-OmpTS (2 100 bp),was obtained by overlap PCR.Then the recombinant expression plasmid,pET28a-OmpA-OmpTS,was constructed and introduced into the host strain,escherichia coli BL21 (DE3).The conditions for fusion protein expression were that with the addition of 1 mM IPTG after 2 h of the strain growth at 16 ℃ for 16 h.The recombinant protein,OmpA-OmpTS was purified and mixed with the adjuvant (FIA) to be injected to the zebra fish to test its protection effect againstAeromonashydrophila.The immunoprotectivity reached 87.5%,indicating that this fusion protein can be a candidate vaccine for further development.

Aeromonashydrophila; outer membrane protein; prokaryotic expression; immunoprotection

2017-08-10

國家自然科學基金項目(31301059)； 陜西省科技廳自然科學基礎研究計劃面上項目(2017JM3010)； 陜西省科技廳自然科學基礎研究計劃青年項目(2013JQ3011)； 陜西省大學生創新創業訓練計劃項目(1326); 陜西科技大學博士科研啟動基金項目(BJ12-24)

劉 望(1991-)，男，陜西西安人，在讀碩士研究生，研究方向：食源性病原微生物

劉 歡(1983-)，女，陜西西安人，講師，博士，研究方向：食源性病原微生物，liuhuan@sust.edu.cn

2096-398X(2017)06-0125-06

S917.1

A