連接鏈對包含CisoDGRC結構抗菌肽誘導乳腺癌細胞凋亡的影響

侯 磊,岳晨莉,何 莉,賈 輝,白 俊*

(1陜西省人民醫(yī)院腫瘤內科,西安 710068;2武警陜西省總隊醫(yī)院呼吸內科;3西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科;*通訊作者,E-mail:edgemen@163.com)

連接鏈對包含CisoDGRC結構抗菌肽誘導乳腺癌細胞凋亡的影響

侯 磊1,岳晨莉2,何 莉1,賈 輝3,白 俊1*

(1陜西省人民醫(yī)院腫瘤內科,西安 710068;2武警陜西省總隊醫(yī)院呼吸內科;3西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科;*通訊作者,E-mail:edgemen@163.com)

目的 分別使用LLII和GG寡肽作為連接鏈,構建包含CisoDGRC結構的抗菌肽(CDAK,CGAK),探討連接鏈的不同對包含CisoDGRC結構抗菌肽誘導αvβ3陽性乳腺癌細胞凋亡能力的影響。 方法 不同濃度CDAK(LLII)與CGAK(GG)作用于MDA-MB-231細胞24 h,使用CCK-8計算CDAK與CGAK的半數致死量(IC50)。PBS(control)、隨機肽(CRLK)、CDAK(LLII)與CGAK(GG)分別作用于MDA-MB-231細胞24 h,流式細胞儀分析四組細胞凋亡率和線粒體膜電位,Western-blot分析四組細胞中cleaved-Caspase-3蛋白表達情況。 結果 在MDA-MB-231細胞中,CGAK IC50較CDAK減少。CGAK組和CDAK組較control組和CRLK組,凋亡細胞比例與cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量增多(P<0.05),線粒體膜電位降低(P<0.05)。CGAK組相較CDAK組,凋亡細胞比例及cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量增多(P<0.05),膜電位之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CRLK組與control組各指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結論 作為連接鏈,GG較LLII能夠進一步提高包含CisoDGRC結構抗菌肽誘導αvβ3陽性乳腺癌細胞凋亡的能力。

連接鏈; 乳腺癌; 抗菌肽; 細胞凋亡

近年來由于噬菌體展示技術的運用,越來越多的能夠特異性識別腫瘤的小分子多肽被發(fā)現[1]。多肽相對于蛋白質來講,長度僅為10-30個氨基酸,具有較低的免疫原性和抗耐藥性,并且高效低毒,易于合成、重組與改造,成為抗腫瘤新藥開發(fā)的良好生物分子[2]。目前,利用多肽抗腫瘤的研究中,多肽復合物通常由3部分構成,2個功能結構域和1個連接域[3-5]。兩個功能結構域分別扮演著腫瘤導向作用和腫瘤殺傷或示蹤作用,可將其稱為引導域和功能域。引導域通常模仿一些配體和抗體的識別序列,能夠特異性識別并結合腫瘤細胞膜上相對高表達的受體。如NGR序列,能夠特異性識別腫瘤細胞表面高表達的氨基肽酶N(CD13),而研究進一步發(fā)現,NGR不僅能夠識別CD13,而且能夠通過脫酰胺作用轉變成isoDGR結構,使其對一種在腫瘤細胞膜上高表達的黏附因子αvβ3具有較高的親和力,并且發(fā)現isoDGR結構通過雙硫鍵形成的環(huán)形結構(CisoDGRC)能夠進一步增加其親和力與穩(wěn)定性[6,7]。因此對于αvβ3陽性腫瘤細胞,CisoDGRC結構是一種理想的引導域選擇。功能域通常由具有誘導腫瘤細胞凋亡和抑制其增殖的活性物質構成[8,9]。如抗菌肽,因其肽鏈具有陽離子的α-螺旋結構,使其能夠與腫瘤細胞膜及線粒體膜所帶負電荷的磷脂相互作用,進而誘導細胞凋亡,所以常被作為一種抗腫瘤活性物質,目前已發(fā)現超過190種具有抗腫瘤功能的抗菌肽[10,11]。因(KLAKLAK)2結構具備抗菌肽所特有的陽離子α-螺旋結構,因此常被作為抗菌肽用于研究[12]。本研究在前期實驗中使用CisoDGRC作為引導域,(KLAKLAK)2結構作為功能域,構建了一種針對αvβ3陽性乳腺癌細胞特異性的抗腫瘤多肽,并在實驗中驗證了其具有特異性識別和殺傷αvβ3陽性乳腺癌細胞的能力[13]。

目前,該領域研究主要集中在篩選較強特異性和更高親和力的引導域與更具殺傷性的功能域,對于連接鏈的關注較少。然而連接鏈的不同能夠影響多肽空間結構,而空間結構的改變能夠進一步影響整個多肽的活性,因此連接鏈也是一個需要重視的領域。本研究中,在前期已構建的抗腫瘤多肽基礎上,結合文獻報道[12,14],在引導域和功能域不變的情況下,將連接鏈由LLII序列更換為GG結構,比較更換后抗腫瘤多肽在誘導αvβ3陽性乳腺癌細胞凋亡能力上是否發(fā)生了改變。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

L-15不完全培養(yǎng)液購買于江蘇凱基生物技術股份有限公司,肽牛血清購買于杭州四季青生物工程材料有限公司。兔抗人cleaved-Caspase-3抗體購買于美國cell signaling technology公司。Annexin-Ⅴ/PI雙染凋亡試劑盒、CCK-8試劑盒購買于上海七海復泰生物科技有限公司。免疫印跡增強化學發(fā)光法試劑盒購買于美國Thermo公司。蛋白裂解液(Ripa)購買于陜西先鋒生物科技有限公司。

1.2 細胞株與多肽合成

1.3 細胞培養(yǎng)

MDA-MB-231細胞采用L-15不完全培養(yǎng)液(含10%肽牛血清)在5%CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。毎2-3 d傳代1次,待細胞處于對數生長期后行后續(xù)實驗。

1.4 細胞毒性檢測

MDA-MB-231細胞接種于96孔板,用含不同濃度CDAK(20,40,100,200,400 μg/ml)、CGAK(20,40,100,200,400 μg/ml)培養(yǎng)液100 μl孵育24 h,設4個復孔,結束培養(yǎng)前4 h各孔中加入10 μl CCK-8溶液,酶標儀讀取各孔A450值,取均值,未加多肽孔代表100%細胞存活,計算細胞存活百分比。使用軟件Graphpad Prism 5.0計算細胞半數致死量(IC50)。

1.5 流式細胞儀分析細胞凋亡

用含PBS(多肽同體積)、CRLK(200 μg/ml)、CDAK(200 μg/ml)、CGAK(200 μg/ml)培養(yǎng)液孵育MDA-MB-231細胞24 h,胰酶消化細胞后,取5×105細胞加入500 μl 1×Binding Buffer重懸,加入5 μl AnnexinⅤ-FITC室溫避光15 min,10 μl PI冰浴5 min,400目篩網濾過細胞懸液后上機檢測。同時以不加AnnexinⅤ-FITC及PI的細胞懸液作為陰性對照。

1.6 流式細胞儀分析線粒體膜電位

用含PBS(多肽同體積)、CRLK(200 μg/ml)、CDAK(200 μg/ml)、CGAK(200 μg/ml)培養(yǎng)液孵育MDA-MB-231細胞24 h,胰酶消化細胞,PBS洗滌細胞2次,加入JC-1工作液500 μl,將細胞均勻懸浮,細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min,JC-1緩沖液洗滌2次,重懸后400目篩網濾過細胞,流式細胞儀分析。

1.7 Western-blot檢測cleaved-Caspase-3蛋白

用含PBS(多肽同體積)、CRLK(200 μg/ml)、CDAK(200 μg/ml)、CGAK(200 μg/ml)培養(yǎng)液孵育MDA-MB-231細胞24 h,含有蛋白酶抑制劑的裂解液提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度。相同劑量蛋白樣品使用SDS-PAGE分離,目的條帶使用PVDF膜轉膜,含5%脫脂牛奶的TBS-T封閉2 h,加一抗后4 ℃溫育過夜,TBS-T洗3次,每次15 min,加相應二抗,室溫溫育1 h,TBS-T洗3次,每次15 min,ECL發(fā)光法檢測蛋白表達狀況。膠片掃描成圖片后使用Image-Pro Plus軟件進行灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 多肽對MDA-MB-231細胞毒性

使用CCK-8檢測CDAK、CGAK對MDA-MB-231細胞毒性,并計算IC50值。CDAK、CGAK對細胞均有生長抑制作用(P<0.05,見圖1),且呈現劑量依賴性。24 h的IC50(半數致死量)分別為:263 μg/ml(CDAK)、218 μg/ml(CGAK)。實驗結果表明,兩種多肽均能抑制MDA-MB-231細胞生長,且相對于CDAK,CGAK細胞毒性更大。

圖1 不同濃度CDAK和CGAK作用于MDA-MB-231細胞24 h的細胞存活率Figure 1 Cell survival rate of MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of CDAK or CGAK for 24 h

2.2 多肽對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測CDAK、CGAK、CRLK對MDA-MB-231細胞凋亡的影響,結果顯示:CDAK、CGAK、CRLK作用24 h后,MDA-MB-231凋亡率分別為(22±2.61)%，(32±2.77)%，(10±1.02)%。結果表明,相對于control,CDAK、CGAK均能誘導MDA-MB-231細胞凋亡(P<0.05),而CRLK對細胞凋亡并無明顯影響(P>0.05,見圖2)。CGAK相較于CDAK,誘導細胞凋亡能力明顯增加,且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2)。提示CGAK具有更強誘導MDA-MB-231細胞凋亡的能力。

2.3 多肽對MDA-MB-231細胞線粒體膜電位的影響

流式細胞儀檢測CDAK、CGAK、CRLK對MDA-MB-231細胞線粒體膜電位的影響,結果顯示:CDAK、CGAK、CRLK孵育細胞24 h,反應MDA-MB-231細胞線粒體膜電位的熒光比值分別為1.8±0.24,1.7±0.37,3.4±0.33。結果表明,相對于control組,CDAK和CGAK能夠明顯降低細胞線粒體膜電位(P<0.05),但CDAK組與CGAK組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而CRLK對細胞線粒體膜電位并無明顯影響(P>0.05,見圖3)。表明CDAK、CGAK均具有損傷MDA-MB-231細胞線粒體膜的功能,但兩者之間差異并無統(tǒng)計學意義。

2.4 多肽對MDA-MB-231細胞cleaved-Caspse-3蛋白的影響

使用Western-blot檢測cleaved-Caspase-3蛋白表達,結果顯示:相較于control組,CDAK組和CGAK組細胞cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量均增加(P<0.05),且CGAK組蛋白相對表達量高于CDAK組(P<0.05)。CRLK組蛋白相對表達量較control組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖4)。表明CDAK與CGAK均能誘導cleaved-Caspase-3蛋白表達,并且相較于CDAK,CGAK能夠誘導更多cleaved-Caspase-3蛋白表達。

3 討論

抗菌肽由富含正電荷的兩性氨基酸構成,與帶負電荷的細胞膜能夠相互作用,通過電子吸引力作用于細胞膜,極性區(qū)域插入胞膜內,導致胞膜穩(wěn)定性下降,進而破壞細胞膜引起細胞凋亡、死亡,或是形成孔道使抗菌肽進入細胞內,損傷線粒體膜誘導凋亡發(fā)生。腫瘤細胞膜由于其表面易暴露更多的負電磷脂,細胞膜穩(wěn)定性差,因而對抗菌肽更加敏感[15,16]。本研究中構建的兩條抗菌肽,不僅抑制了乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖,并且誘導了其凋亡的發(fā)生,促進了Caspase-3的生成。進一步證實了抗菌肽能夠誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)生。同時線粒體膜電位檢測,證實兩種多肽均能損傷MDA-MB-231細胞線粒體進而誘導細胞凋亡。

與control組比較,*P<0.05;與左側相鄰組比較，#P<0.05圖2 流式細胞儀檢測不同多肽作用MDA-MB-231細胞24 h細胞凋亡率Figure 2 The apoptosis of MDA-MB-231 cells treated with different peptides for 24 h analyzed using flow cytometry

為了提高抗菌肽的腫瘤特異性殺傷作用,目前研究多是通過增加一個有效載體,攜帶抗菌肽定位于腫瘤組織,發(fā)揮治療作用。隨著噬菌體展示技術發(fā)展,已篩選出眾多能夠特異性識別和結合腫瘤細胞表面受體的小分子多肽。如經典的RGD模序和NGR模序,可以靶向定位于腫瘤和腫瘤血管。本研究構建的抗菌肽選擇了CisoDGRC序列作為載體。isoDGR由NGR序列脫酰胺作用后生成,NGR到isoDGR轉變失去其識別CD13的能力,但獲得可結合avb3的能力[6]。avb3是一種整合素,在腫瘤細胞上過表達,負責黏附和遷移。同時對isoDGR序列的研究表明,環(huán)狀isoDGR(CisoDGRC)具有二硫橋限制的基序可增加腫瘤靶向效率和彎曲構象的穩(wěn)定性[7]。因此,本研究前期實驗選擇CisoDGRC序列作為載體,引導抗菌肽作用于CD13(-)avb3(+)乳腺癌細胞[13],結果表明,構建的抗菌肽CDAK的確能夠特異性識別CD13(-)avb3(+)乳腺癌細胞MDA-MB-231。

與control組比較，*P<0.05圖3 流式細胞儀檢測不同多肽作用MDA-MB-231細胞24 h線粒體膜電位Figure 3 The mitochondrial membrane potential of MDA-MB-231 cells treated with different peptides for 24 h analyzed using flow cytometry

圖4 Western-blot檢測不同多肽作用MDA-MB-231細胞24 h cleaved-Caspase-3蛋白表達Figure 4 The protein expression of cleaved-Caspase-3 in MDA-MB-231 cells treated with different peptides for 24 h analyzed using Western-blot

目前對于抗腫瘤多肽研究,主要集中在尋找一個更加有效的載體和抗腫瘤活性更強的多肽上。而對于構成抗腫瘤多肽非常關鍵的連接部分缺乏足夠重視。眾所周知,蛋白質的功能與其空間結構密切相關,而空間結構主要受氨基酸序列影響。因此,氨基酸序列不同可以影響到多肽結構,進而導致其功能改變。本實驗中,將已證實具有識別avb3陽性乳腺癌細胞,并能夠誘導其凋亡的抗菌肽CDAK,所含有的連接鏈進行改造。通過查閱文獻,選擇連接鏈GG結構,理論上甘氨酸殘基由于分子結構小,不能形成穩(wěn)定的α螺旋或β折疊結構,使多肽具有更加靈活的活動度和彎曲性,增加了抗菌肽部分靠近細胞膜的幾率,進而能夠增加其抗腫瘤活性。本實驗結果也表明,連接鏈的改變的確增加了抗菌肽誘導MDA-MB-231凋亡的能力,但檢測線粒體膜電位結果顯示,CGAK相對于CDAK在降低線粒體膜電位上并無明顯優(yōu)勢。為何凋亡率增加而線粒體膜電位無改變,需要進一步去研究。同時,連接鏈的改變是否在體內實驗中有一致結果,在其他抗腫瘤多肽中是否也能改變多肽的抗瘤活性,及是否還存在更加合適的連接鏈為本課題組進一步的研究方向。

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EffectofconnectionchainonapoptosisinducedbyantibacterialpeptidecontainingCisoDGRCinbreastcancercells

HOU Lei1,YUE Chenli2,HE Li1,JIA Hui3,BAI Jun1*

(1DepartmentofMedicalOncology,ShaanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,ShaanxiProvincialCorpsHospital;3DepartmentofOncology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:edgemen@163.com)

ObjectiveTo construct antibacterial peptides CDAK and CGAK containing CisoDGRC structure respectively using LLII and GG peptides as a link chain, and to explore the effects of different connection chains on the ability of antibacterial peptides containing CisoDGRC structure to induce apoptosis in αvβ3-positive breast cancer cells.MethodsMDA-MB-231 cells were treated with different concentrations of CDAK(LLII)and CGAK(GG)for 24 h. The CCK-8 kit was used to calculate the median lethal dose(IC50) of CDAK and CGAK. PBS(control), random peptide(CRLK), CDAK(LLII)and CGAK(GG)were applied to MDA-MB-231 cells for 24 h. Flow cytometry was used to analyze the apoptotic rate and mitochondrial membrane potential in the four groups. Western-blot was used to analyze the cleaved-Caspase-3 protein expression in the four groups.ResultsIn MDA-MB-231 cells, IC50of CGAK decreased compared with CDAK. Compared with control group and CRLK group, the proportion of apoptotic cells and cleaved-Caspase-3 protein relative expression increased in CGAK group and CDAK group(P<0.05), while the mitochondrial membrane potential decreased(P<0.05). Compared with CDAK group, the proportion of apoptotic cells and cleaved-Caspase-3 protein relative expression increased in CGAK group(P<0.05), while the difference of membrane potential was not statistically significant(P>0.05). There was no significant difference in all indexes between control group and CRLK group(P>0.05).ConclusionAs a linker, GG can further enhance the ability of antibacterial peptides containing CisoDGRC structure to induce the apoptosis of αvβ3-positive breast cancer cells compared with LLII.

connection chain; breast cancer; antibacterial peptides; apoptosis

陜西省自然科學基礎研究計劃項目(2016JM8094)

侯磊,男,1979-09生,博士,主治醫(yī)師,E-mail:zhaoyalan1981@163.com

2017-08-19

R737.9

A

1007-6611(2017)11-1149-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.11.013