1株耐熱纖維素酶產生菌的篩選及其酶學特性

金偉+陳文靜+繆禮鴻+劉蒲臨

摘要：采用富集培養并結合濾紙條降解法進行初篩，從土壤中分離到1株產纖維素酶能力較強的耐熱真菌XT3。通過菌株的形態特征和18S rDNA序列同源性比較，該菌株被鑒定為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。發酵試驗表明，XT3菌株產酶培養的最適起始pH值為4.0，最適產酶發酵溫度為45 ℃；該菌株產生的羧甲基纖維素（CMC）酶和濾紙酶的最適作用溫度分別為80、70 ℃，具有較好的耐熱性、耐酸性。此外，研究還表明，XT3菌株能夠較好地利用木薯酒糟液發酵產纖維素酶，在木薯酒糟液培養基中添加2%麩皮可使發酵液的纖維素酶活性提高2.1倍，表明該菌株具有潛在的應用價值。

關鍵詞：纖維素酶；煙曲霉；耐高溫真菌；篩選；木薯酒糟培養液

中圖分類號： Q939.96；S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0272-03

纖維素的降解由內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶協同完成。纖維素酶在微生物中廣泛存在，但是微生物所產纖維素酶的熱穩定性往往并不理想，絕大部分真菌纖維素酶的最適反應溫度一般為50～60 ℃[1]。耐熱酶在工業應用中具有許多突出的優點，嗜熱微生物及其產生的耐熱酶一直是國內外的研究熱點之一[2-3]。

木薯酒糟利用的是木薯生產乙醇后的殘渣，由于其纖維質含量較高，一般不宜直接作為飼料，如不加以合理利用將造成資源浪費[4]。新鮮木薯酒糟液具有高溫、濕熱和偏酸的特點，因此，利用木薯酒糟液培養耐熱真菌生產高溫纖維素酶具有潛在的經濟價值。本研究報道了1株從土壤中篩選的產高溫纖維素酶的耐熱真菌，對該菌的產酶條件和部分酶學特性進行研究，并進一步探索利用木薯酒糟培養高溫真菌生產耐熱纖維素酶的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 本研究菌種分別是從武漢市、廈門市周邊地區富含纖維素的土壤中分離獲得的。黑曲霉為筆者所在實驗室保存。木薯酒糟液（含干基4%）由廣西中糧生物質能源有限公司提供。

1.1.2 培養基及試劑 （1）富集培養基：取1 000 mL木薯酒糟，用15%H2SO4、NaOH溶液調節pH值為4.0～5.0。（2）羧甲基纖維素（CMC）瓊脂培養基：10 g羧甲基纖維素鈉，4 g （NH4）2SO4，2 g KH2PO4，0 5 g MgSO4·7H2O，0.5 g MnSO4，20 g瓊脂，加蒸餾水至1 000 mL，調節pH值為4.0～5.0。（3）復篩液體培養基：10 g羧甲基纖維素鈉，4 g （NH4）2SO4，2 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g MnSO4，加蒸餾水至 1 000 mL，調節pH值為4.0～5.0。（4）PDA培養基：200 g馬鈴薯，20 g蔗糖，20 g瓊脂，加蒸餾水至1 000 mL，pH值自然。（5）濾紙條崩解培養基：1.5 g牛肉膏，1.0 g蛋白胨，2.0 g CaCO3，加蒸餾水至1 000 mL。每個試管分裝成高7 cm深層，并放入1條11 cm×6 cm濾紙條。（6）發酵培養基：1 000 mL木薯酒糟液，4 g （NH4）2SO4，2 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g MnSO4，pH值4.0～5.0。比較不同碳源培養基發酵效果時，分別用40 g稻草或40 g麩皮加960 mL蒸餾水替代木薯酒糟液，其余成分同上。（7）不同起始pH值稻草發酵培養液：用15%H2SO4、NaOH溶液分別調節稻草發酵培養液的起始pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。以上培養基均在121 ℃濕熱滅菌20 min后使用。

1.2 耐高溫產纖維素酶菌株的篩選方法

取枯枝落葉下5～10 cm的土壤樣品10 g，加至90 mL無菌水中搖勻，制成土壤懸液，取1mL土壤懸液接種于富集培養基中，50 ℃、170 r/min培養2 d后，將適當稀釋的菌液分別涂布于pH值4.0～5.0的初篩培養基平板上，50 ℃培養3 d。挑取部分在初篩平板上生長較大的單菌落，分別劃線轉接至纖維素培養基上純化1～2次后，進行菌株編號保藏。取初篩保存的各菌株分別接入濾紙條崩解培養基，培養10 d后，濾紙條培養液中出現不同深度的黃色膠狀物，濾紙發生不同程度的潰爛。根據培養液黃色深淺及濾紙條的腐爛程度，選取對纖維素降解能力較強的菌株用于酶活性的測定。

1.3 纖維素酶活性的測定

1.3.1 葡萄糖標準曲線的測定 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定。

1.3.2 羧甲基纖維素酶（簡稱CMCase）活性的測定[5] 每個菌株取5 mL發酵液，4 000 r/min離心10 min，取上清液，即為粗酶液。在25 mL刻度試管中先加入3 mL 1%CMC溶液，再加入1.0 mL粗酶液，搖勻。樣品放入50 ℃水浴中保溫反應l h后，立即加入1.5 mL DNS試劑，然后各樣品及空白對照同時放入沸水浴中反應5 min，取出后立即置于水中冷卻，540 nm處測定其吸光度。酶活性單位定義：在一定的反應條件（pH值、溫度）下，1 h內由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活性單位（U）。

CMC酶最適溫度的測定：設置50、60、70、80、90 ℃ 5個溫度梯度，讓酶液與1%CMC在對應溫度下充分反應1 h，測定540 nm下的吸光度，得到該酶的最適作用溫度。

1.3.3 濾紙酶活測定[6] 取3 mL pH值4.8檸檬酸緩沖液，加入1 cm×6 cm新華定量濾紙，再加入粗酶液1.0 mL，50 ℃恒溫水浴保持l h，加入1.5 mL DNS試劑于沸水浴中放置 5 min，冷卻定容后于540 nm處測定其吸光度，用DNS法測定還原糖含量。在上述條件下，定義1 h催化水解底物生成 1 μmol 葡萄糖所需的酶量為1個酶活性單位（U）。endprint

1.4 高溫真菌DNA提取、PCR及18S rDNA序列比對方法[7]

18S rRNA基因分析：使用18S通用引物5′-GGAAGGG

RTGTATTTATTAG-3′、5′-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3′進行PCR擴增。測序由上海博亞公司完成，序列比對在NCBI數據庫中進行。

2 結果與分析

2.1 耐高溫產纖維素酶真菌的分離及酶活性比較

從30株耐高溫真菌中初步選出7株對濾紙條降解能力較強的菌株，分別編號為XT3、E4、XMY3、D5、D6、D3、L8。將這7株菌株分別接種于木薯酒糟發酵培養基中，于50 ℃、170 r/min 下培養2 d，測定各菌株CMCase活性和濾紙酶活性。由圖1可以看出，這7株菌株中，菌株XT3的濾紙酶活性、CMC活性均最高，分別為1.982、2.112 U/mL。

2.2 XT3菌株的分類鑒定結果

XT3菌株的顯微形態觀察結果顯示，該菌株的分生孢子梗較短，頂端膨大呈圓形的頂囊上附著許多單層或雙層的小梗，末端著生分生孢子（圖2），從其產孢結構看，該菌株是典型的曲霉屬真菌。為了進一步確定該菌的分類地位，用通用引物擴增出其18S rDNA序列，將XT3菌株測序得到的18S rDNA序列（1 080個堿基對）在NCBI上進行BLAST比對。結果表明，XT3的18S rDNA序列與GenBank數據庫中煙曲霉（Aspergillus fumigatus） ATCC3627的同源性達100%。因此，根據XT3菌株的形態特征和18S rDNA序列對比結果，可將XT3菌株鑒定為1株煙曲霉。

2.3 發酵條件對菌株XT3產酶活性的影響

2.3.1 碳源對菌株XT3產酶的影響 將XT3分別接種于木薯酒糟液培養基、4%稻草培養基、4%麩皮培養基中，50 ℃、170 r/min搖床培養2 d后，分別測定CMCase活性、濾紙酶活性。由圖3可以看出，XT3菌株在木薯酒糟液培養基中的濾紙酶活性、CMCase活性均最高，分別為1.97、2.04 U/mL，其濾紙酶活性是在稻草培養基中的2.2倍。

2.3.2 起始pH值對菌株XT3產酶的影響 將XT3接種于不同pH值的木薯酒糟液培養基中，50 ℃、170 r/min搖床培養2 d后分別測定發酵液CMCase活性、濾紙酶活性。從圖4可以看出，XT3菌株在木薯酒糟液pH值4.0時，其濾紙酶活性、CMCase活性均達到最高值，表明XT3菌株產生的纖維素酶具有較好的耐酸性。

2.3.3 培養溫度對菌株XT3產纖維素酶活的影響 將XT3分別接種于pH值4.0的木薯酒糟液培養基中，于不同溫度、170 r/min搖床培養2 d后，分別測定CMCase活性、濾紙酶活性。圖5表明，培養溫度為45 ℃時XT3菌株的濾紙酶活性、纖維素酶活性最高，分別為2.82、2.61 U/mL。

2.3.4 不同添加物對菌株XT3產纖維素酶的影響 將菌株XT3分別接種于木薯酒糟液以及添加1%麩皮、2%麩皮、01%吐溫-80、0.2%吐溫-80、0.2%洗衣粉的木薯酒糟液培養基中，于50 ℃、170 r/min搖床培養2 d后測定CMCase活性和濾紙酶活性。圖6表明，添加2%麩皮的木薯酒糟液培養基產纖維素酶效果最好，其CMCase活性達 3.836 U/mL，是不添加任何成分的對照培養基酶活性的21倍。

2.4 XT3菌株產纖維素酶最適酶促反應溫度測定

將XT3菌株和1株黑曲霉菌株分別接種于pH值4.0的木薯酒糟液培養基中，分別于45、35 ℃搖床培養2 d，得到粗酶液，在不同反應溫度下測定其CMCase酶活性、濾紙酶活性。由圖7可以看出，XT3菌株的CMC酶活性在80 ℃最高，達25 U/mL，是黑曲霉最高酶活性的1.5倍。XT3菌株的濾紙酶活性在70 ℃時最高，達2.11 U/mL，為黑曲霉最高酶活性的14倍，表明XT3菌株產生的纖維素酶具有較好的耐熱性。

3 結論與討論

本研究從土壤中分離和篩選到1株產纖維素酶活性較高的耐熱真菌XT3菌株，經鑒定為1株煙曲霉。該菌株產酶培養基的最適起始pH值為4.0，最適產酶溫度為45 ℃。XT3菌株產生的CMC酶、濾紙酶的最適溫度分別為80、70 ℃。目前，國內已有報道表明，嗜熱真菌產纖維素酶的最適溫度為60 ～ 70 ℃[8-12]， 因此XT3菌株所產生的嗜熱纖維素酶具有深入研究的價值。

XT3菌株能夠較好地利用木薯酒糟液發酵產纖維素酶，與不添加任何成分的木薯酒糟液培養基相比，XT3菌株在添加2%麩皮的木薯酒糟液培養基中產纖維素酶能力提高了21倍，表明利用嗜熱或耐熱真菌資源開發利用木薯酒糟生產耐高溫纖維素酶具有潛在的應用價值。

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