貴州獼猴桃潰瘍病病菌分離鑒定及其培養特性

龍云川+彭熙+李葦潔+劉曼+萬合鋒+任春光

摘要：以貴州省獼猴桃基地內獼猴桃感病組織為材料，采用組織分離法分離純化獲得1株病原菌菌株，并從形態、生理生化、16S rDNA序列對其進行鑒定，進一步研究該菌株在不同培養條件下的生長情況。結果表明，通過致病性測定及形態、生理生化、16S rDNA分析，明確該菌株為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv.actinidae）；培養基種類、pH值、溫度會對病原菌的生長產生一定影響，菌株生長相對最適培養基為Luria-Bertani（LB）培養基，最適培養條件為pH值7.5、溫度15 ℃。

關鍵詞：獼猴桃；潰瘍病；丁香假單胞菌；培養特性；16S rDNA

中圖分類號： S436.634.1+9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0114-03

獼猴桃享有水果之王、世界珍果之美譽，維生素C含量豐富，是等質量蘋果的20～80倍[1]。據統計，世界獼猴桃栽培面積約20萬hm2，而我國獼猴桃栽培面積占世界份額已超過50%[2]。獼猴桃潰瘍病是一種嚴重威脅獼猴桃生產的毀滅性細菌性病害，來勢兇猛，具有傳播快、致病性強、范圍廣、防治難度大等特點[3]，1996年被列為全國森林植物檢疫對象，2009年國家質量監督檢驗檢疫總局將其列入禁止入境的有害生物名單，2013年國家林業局將其視為林業危險性有害生物[4]。

貴州是我國獼猴桃分布中心之一，在修文、六盤水、甕安等地有大規模種植[5]。近年來，隨著獼猴桃種植面積的擴大及對外引種頻繁，獼猴桃潰瘍病有蔓延趨勢[6]。2014—2015年春，對貴州省各獼猴桃基地調查發現，部分果園有潰瘍病零星發生，科學預防控制獼猴桃潰瘍病害的發生、發展，對獼猴桃產業及食品安全至關重要。植物病原菌在侵染傳播過程中，其菌株易發生變異分化[7]，而病原菌的培養特性是病原菌致病機理、病害流行及防治研究的基礎[8]，貴州省尚無對獼猴桃潰瘍病菌分離和其培養特性系統研究的報道。本試驗從獼猴桃感病組織分離得到病原菌，并對該菌株進行生理生化和分子鑒定，研究菌株在不同培養基種類、pH值、溫度、光照等條件下的培養性狀，以期摸清獼猴桃潰瘍病田間發生和流行規律，為其科學防控提供參考與指導。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

2015年3—4月，在貴州六枝特區、修文縣等獼猴桃產業園內選擇具有代表性的獼猴桃栽培地，根據發病情況和受害程度采集典型標本帶回實驗室鑒定。

1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL；牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH值7.2～7.4；Luria-Bertani（LB）培養基：胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，酵母膏10 g，水1 000 mL，pH值7.2；SPA培養基[9]：蔗糖20 g，蛋白胨5 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，水1 000 mL，pH值7.2～7.4；肉汁胨（BPA）培養基[10]：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，蔗糖10 g，酵母膏1 g，水1 000 mL，pH值7.0。瓊脂固體培養基在此基礎上添加1.8%瓊脂。

1.3 病原菌分離

取獼猴桃感病組織制片，在德國Carlzeiss生產的Laboval-4型顯微鏡下進行鏡檢，檢查有無菌絲、子實體、孢子、菌核、菌索、病原線蟲蟲體、蟲卵等，判定病原是否為真菌或線蟲；將感病組織用無菌水沖洗，用75%乙醇擦拭；超凈臺上用無菌手術刀片在病健交界處切取5 mm見方的小塊，用75%乙醇消毒20 s；無菌水沖洗3遍，接種于PDA、牛肉膏蛋白胨培養基上恒溫培養，重復3次，以獼猴桃基地健康植株組織為空白對照。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 致病性測定 將純化后的菌株配成108 CFU/mL菌液，采用針刺法對獼猴桃健康葉片進行離體接種；將接種的葉片放入墊有濕潤濾紙的培養皿中，30 ℃恒溫培養箱中培養，定期觀察并記錄發病情況[6]。

1.4.2 菌株形態及生理生化特征觀察 用平板劃線法[11]將菌種接種于平板培養基上，30 ℃培養24 h，從菌落大小、形狀、邊緣、光澤、質地、透明程度及培養基顏色等進行觀察。參照《常見細菌系統鑒定手冊》《伯杰細菌鑒定手冊》開展接觸酶試驗、乙酰甲基甲醇試驗（V-P）試驗、淀粉水解試驗、硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、明膠液化試驗、碳源利用試驗等，對菌株進行生理生化鑒定[12-13]。

1.4.3 分子生物學鑒定 按照生工生物工程（上海）股份有限公司的SK8255試劑盒操作說明提取基因組DNA。擴增16S rDNA序列片段采用16S rRNA基因通用引物，上游引物為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物為：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。采用50 μL PCR反應體系：10×Taq buffer（15 mmol/L MgCl2）5 μL，dNTP混合物（2.5 mmol/L） 4 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O補足50 μL。PCR循環反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸 10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測、染色、凝膠成像，送寶生物工程（大連）有限公司測定序列，并與NCBI數據庫做Blast分析；采用Clustal X軟件將序列與標準菌株片段進行比對，運用Mega 5.2軟件采用Neighbor Joining方法構建系統發育樹，分析其親緣關系。endprint

1.5 病原菌培養特性

菌株在BPA液體培養基中活化24 h，按1%的接種量分別將培養菌液接種于50 mL pH值為7.0的不同種類液體培養基、不同pH值的BPA培養基中，30 ℃ 150 r/min無光照培養24 h，用分光光度計測定波長為600 nm時的吸光度（D600 nm），同時研究菌株在pH值為7.0的BPA培養基中不同光照、不同溫度對其生長的影響。按1%的接種量將菌液接種于優勢培養基中，在優化培養條件下振蕩培養，每隔3 h取樣測定D600 nm；以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制生長曲線。所有測定重復3次。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離及形態特征

試驗結果表明，從多個感病組織（圖1）均可分離出菌落形態一致的菌落，而健康組織未分離出菌株；將菌株挑出，純化，制成菌液，用針刺法對獼猴桃新鮮健康葉片進行接種，葉片出現褐色病斑，而接種無菌水的獼猴桃葉片正常，說明該菌株R01有致病性；致病菌菌落在牛肉膏蛋白胨培養基上呈乳白色、圓形、光滑、半透明、生長緩慢、表面濕潤黏稠、易挑取；革蘭氏染色為陰性，鏡檢發現該病原菌的菌體為直桿狀或短桿狀，有的稍彎曲，大小為（1.2～2.4） μm×（0.2～0.5）μm，兩端鈍圓，單生（圖2）。

2.2 病原菌生理生化鑒定

試驗結果表明，分離出的菌株接觸酶試驗、過氧化氫酶試驗均表現為陽性，能利用葡萄糖、蔗糖、果糖；吲哚試驗、V-P試驗、硝酸鹽還原試驗、氧化酶、淀粉水解試驗、明膠液化試驗均表現為陰性，不能利用海藻糖、麥芽糖。

2.3 分離菌株16S rRNA基因序列分析

病原菌菌株16S rDNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果由圖3可見，菌株R01的特異性片段大小約為1.5 ku；DNA提取效果相對較好，可用于16S rDNA序列測定分析。16S rRNA測序結果在GenBank數據庫中的登錄號為KU543670，經Blast分析顯示，菌株R01序列與丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種菌株AB001439.1相似度為99%。由圖4可見，分離菌株R01與丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種處于同一分支上，親緣關系相對較近，同源性相對較高。

因此，可確定本試驗分離的獼猴桃潰瘍病病原菌株為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv.actinidae）。

2.4 分離菌株的培養特性

試驗結果表明，菌株R01在不同培養基中的生長差異較大，其中，在SPA、LB培養基中生長相對較好，在PDA培養基中生長相對最差（圖5）；菌株生長的最適pH值為7.5；pH值為6.5～8.0時，菌株也可保持較為旺盛的生長能力（圖6）；菌株的最適生長溫度為15 ℃，溫度較低或較高菌株的生長均較為緩慢，當培養溫度超過25 ℃時，吸光度D600 nm大幅降低，說明此時隨溫度升高，細菌的生長受到抑制（圖7）；研究連續黑暗、光照12 h—黑暗12 h、連續光照3種方式對菌株生長的影響發現，光照對丁香假單胞桿菌的生長沒有顯著影響。由圖8可見，菌株R01剛開始培養時生長緩慢；培養6～9 h，菌株進入指數期快速生長；培養24 h后，菌株生產進入穩定期，其吸光度D600 nm值穩定在1.80左右。

3 結論與討論

對貴州省六枝特區、修文縣等地的獼猴桃潰瘍病病原菌進行分離，在完成致病性鑒定的基礎上，分離到病原菌菌株R01；菌株R01經形態、生理生化及16S rDNA序列分析，明確該菌株為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv.actinidae），與趙利娜等的研究結論[10，14-17]一致，這也說明獼猴桃潰瘍病在侵染傳播過程中其病原菌沒有發生明顯的變異分化。菌株R01能在5～30 ℃溫度條件下生長，其中最適生長溫度為15 ℃；在pH值為6.5～8.0的培養基中也生長較好，而最適pH值為7.5；SPA、LB培養基是菌株R01較為適合的培養基。通過長期田間觀察發現，獼猴桃潰瘍病田間最適發病溫度為12～16 ℃，當溫度達到25 ℃以上，田間幾乎不發病，而本研究的病原菌生長最適溫度與田間最適發病溫度基本一致，這與李黎等的研究結論[3，10，15]較為一致。

由于引起田間發病的因素較為復雜，是多因素共同作用的結果，本試驗僅考慮病原菌的生長快慢，今后應加強該病的致病機理、致病菌與植物互作機制、病原菌次生代謝物等方面的深入研究，為獼猴桃潰瘍病的綜合防治提供科學的理論依據。

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