三角槭秋葉色素的測定及時序變化分析

王紅梅+王永平+陳麗如+王程

摘要：以三角槭葉片為試驗材料，比較了不同浸提液和浸提時間對色素浸提效果的影響，并對測定期內溫濕度的變化與葉綠素、類胡蘿卜素、花青素含量變化的相關性進行了分析。結果發現，適合葉綠素的浸提液為丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1，浸提時間為50 h；適合花青素的浸提液為0.1 mol/L的HCl，浸提時間為50 h。測定期內隨著溫度的降低，葉綠素、類胡蘿卜素都呈下降趨勢，而花青素的含量呈上升趨勢。葉綠素、類胡蘿卜素、花青素與測定期內平均溫度的相關性達顯著水平，而與濕度的相關性不強。

關鍵詞：三角槭；葉綠素；類胡蘿卜素；花青素；時序變化；溫度

中圖分類號： S792.350.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0228-03

三角槭（Acer buergerianum Miq.）又名三角楓，為槭樹科（Aceraceae）槭屬落葉喬木，因其葉片秋季變為暗紅色或橙紅色，成為一種良好的彩葉觀賞樹種。其主要分布區位于長江流域，華北、華南、西南各省也有栽培[1]。對于彩葉樹種變色機制的研究，國外起步較早，早在20世紀90年代，已有學者對紅葉雞爪槭和紅花槭在不同環境條件下葉色的變化進行了研究[2-3]。近年來，國內關于槭樹屬植物的變色生理在紅楓、紫花槭、白牛槭、擰筋槭、茶條槭、五角槭、自由人槭、紅花槭等種或品種中已經有相關報道[4-7]，而對于三角楓變色機制的研究僅榮立蘋等[1]進行了探索。

本研究以栽培于江蘇農林職業技術學院內的三角槭優良單株為試驗材料，研究其轉色期葉片中葉綠素、花青素含量的變化，分析測定期內溫濕度的變化與色素含量的關系，為進一步研究三角槭葉色變化的生理機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為三角槭優良單株，現栽培于江蘇農林職業技術學院，該單株生長健壯，于秋季葉色轉為亮紅色，落葉初期為12月。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣 本試驗于秋季三角槭進入轉色期開始測定，試驗期為2015年10月28日至12月2日。每周采樣1次，采樣時取樹冠向陽面中部當年生枝條的葉片[4，8-9]，同時利用溫濕度測定儀觀測采樣期前1周內的溫濕度變化。

1.2.2 色素的提取

1.2.2.1 葉綠素的提取 將采集的葉片用清水沖洗干凈，擦干，避開主脈，剪碎，并混合均勻[8]。稱取剪碎的葉片0.2 g，放入50 mL的三角瓶中，加入浸提液20 mL。浸提液分別為80%丙酮、丙酮 ∶ 無水乙醇=1 ∶ 1、95%乙醇。倒入浸提液后立即用保鮮膜封口，并用黑色塑料膜將整個瓶子包裹起來，防止漏光。將培養瓶放置于32 ℃的環境下避光恒溫進行浸提，浸提時間分別設定40、45、50 h，浸提過程中搖動幾次。試驗采用雙因素完全隨機組合設計，每個試驗處理重復3次。

1.2.2.2 花青素的提取 稱取剪碎的葉片1 g，放入50 mL三角瓶，加入0.1 mol/L的HCl 10 mL，封口，遮光（方法同葉綠素的提取），采用單因素試驗設計，試驗因子為浸提時間（40、45、50 h），每個處理重復3次。

1.2.3 光密度的測定 用分光光度計在470、645、646、649、663、665 nm的波長下測定葉綠素的D值，在530 nm下測定花青素的D值[10]。

1.2.4 色素的計算 色素計算公式分別用3種不同浸提液的色素濃度（mg/L）的計算公式進行計算，并對計算結果進行比較。80%丙酮作為浸提液的的計算公式為：

Ca=12.72×D663 nm-2.59×D645 nm；（1）

Cb=22.88×D645 nm-4.67×D663 nm；（2）

Ccar=（1 000×D470 nm-3.27×Ca-104×Cb）/229。（3）

丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1為浸提液的計算公式為：

Ca=12.21×D663 nm-2.81×D646 nm；（4）

Cb=20.13×D646 nm-5.03×D663 nm；（5）

Ccar=（1 000×D470 nm-3.27×Ca-104×Cb）/229。（6）

95%乙醇作為浸提液時的計算公式為：

Ca=13.95×D665 nm-6.88×D649 nm；（7）

Cb=24.96×D649 nm-7.32×D665 nm；（8）

Ccar=（1 000×D470 nm-2.05×Ca-114×Cb）/245[11]。（9）

將上述濃度計算結果轉換為色素含量，利用公式：

色素含量（mg/g）=色素濃度（mg/L）×浸提液體積（mL）/[1 000×葉片質量（g）]；（10）

計算色素的相對含量[12]。并對不同計算公式的計算結果進行誤差率的對比。

花青素的計算，以1 g鮮質量葉在10 mL浸提液中的D值為0.1時的花青素濃度記為1個色素單位，計算花青素相對含量（色素單位）[4，13-17]。

1.2.5 溫濕度的測定 空氣溫度和濕度的觀測，利用空氣溫濕度自動記錄儀于色素測定的前1周開始，每天進行觀測和記錄。統計到測定時為止1周的大氣溫濕度的最高、最低、平均值以及極差，并與色素含量變化進行相關性分析[13]。

2 結果與分析

2.1 葉綠素的不同浸提方法的比較

2.1.1 不同浸提效果比較 在比較不同浸提效果時，色素濃度的計算公式分別采用式（1）～（9），色素含量的計算利用公式（10），將計算出的色素含量采用SPSS 19.0進行方差分析和多重比較 （表1）。研究發現，處理4、5、6的葉綠素a、葉綠素b的平均含量之間沒有顯著差異，而這3個處理與其他各處理間均存在顯著差異。類胡蘿卜素平均含量在處理4～9之間無顯著差異，而與其他處理間差異顯著。綜合分析得出：以丙酮與乙醇=1 ∶ 1的浸提液浸提效果最好，與其他2種浸提液間存在顯著差異；而不同浸提時間的各處理間差異不顯著。endprint

2.1.2 不同色素計算公式的比較 浸提液不同，色素的計算公式也不同。固定浸提時間為50 h，以3種不同浸提液浸提色素，并用相應的計算公式進行計算，對其計算結果與采用公式（4）～（6）計算的結果進行比較。以（4）～（6）計算結果為實測值，其他公式計算的為測定值，利用公式：誤差率=（測定值-實測值）/實測值×100%，計算不同測定公式的誤差率（表2）。

經誤差率比較發現，采用不同浸提液計算公式的計算結果誤差率相差很大（表2）。這就說明，在進行色素吸光度測定時波長的選擇必須與浸提液的吸收峰對應，計算也必須運用相應的計算公式，而不能套用Lichtenthaler等對Arnon法進行的修正公式。

2.2 葉綠素的時序性變化

色素時序性變化的試驗，均采用浸提液2（丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1），浸提時間為50 h。在測定期內，每7 d測定1次數據。研究發現，從2015年10月至12月，三角槭的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素a+b均呈短暫上升后急速下降，葉綠素a+b的含量從最大的4.19 mg/g降至0.27 mg/g，類胡蘿卜素含量也有所下降，但下降幅度較為平緩（圖1）。

2.3 花青素的時效性變化

研究發現，在測定期內花青素的相對含量隨著時間的變化呈逐漸增加的趨勢，由7.30增至17.50（圖2）。

2.4 花青素相對含量、類胡蘿卜素與總葉綠素比值的變化

研究發現，在測定期內，花青素與總葉綠素比值呈上升趨勢，但開始上升較為緩慢，至11月中旬后，迅速上升。而葉綠素與類胡蘿卜素比值變化幅度比較小（圖3）。因此，測定株表現在葉片顏色上是由綠變黃并不明顯，但隨著花青素含量的增加，葉片呈現較明顯的紅色。

2.5 測定期內溫濕度的變化

測定期內平均溫度呈下降趨勢，由19.9 ℃下降到 10.8 ℃（圖4）。同時，平均濕度差呈現類似的下降趨勢（圖5）。

2.6 葉綠素、花青素與溫濕度的相關性分析

對葉綠素和花青素含量的變化與溫濕度變化進行相關性分析，結果發現，葉綠素a、類胡蘿卜素的含量均與平均氣溫間存在較強的正相關，即隨著氣溫的降低，葉綠素、類胡蘿卜素含量均降低。其含量與相對濕度的相關性不強，即色素含量的變化受濕度影響較小。花青素的含量與平均氣溫間存在較強的負相關，隨著氣溫的降低，花青素含量逐漸增加，反映了花青素在不斷的合成和積累（表3）。因此， 葉片的顏色也逐漸變為紅色。

3 結論與討論

在三角槭葉片色素和花青素測定中，葉綠素的浸提液以丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1，浸提50 h，效果較好。使用不同浸提液必須使用此浸提液最大吸光度下的計算公式，而不能為了簡便選擇固定公式。

在色素含量的時序性變化中發現，隨著平均氣溫的降低，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素均呈下降的趨勢，而且葉綠素a、類胡蘿卜素與平均氣溫之間存在較強的正相關。花青素的含量隨著平均氣溫的降低而升高，兩者呈現負的強相關。

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