蔬菜、茶葉中克百威酶聯免疫檢測方法的建立

何方洋+馮才偉+杜美紅+王建霞+桑旭升+馮靜

摘要：為建立快速檢測蔬菜、茶葉中克百威殘留的酶聯免疫方法，合成克百威半抗原，并與載體蛋白偶聯合成人工抗原，然后免疫制備其單克隆抗體，在篩選克百威單克隆抗體的基礎上，建立酶聯免疫檢測方法。結果表明，Logit/Log擬合標準曲線為y=-2.054x+0.667 3，相關系數（r）為0.998 5，半數抑制濃度（IC50）為2.3 μg/L，對蔬菜、茶葉樣本的檢測限分別為10、5 μg/kg，加標回收率為79.2%～102.7%，樣本重復檢測的變異系數為5.5%～11.5%。結果表明，建立的酶聯免疫檢測方法具有較好的特異性、準確性和重復穩定性，可用于蔬菜、茶葉中克百威殘留的檢測。

關鍵詞：酶聯免疫法；克百威；蔬菜；茶葉；載體蛋白；單克隆抗體；半數抑制濃度；加標回收率殘留；檢測

中圖分類號： TS207.5+3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0213-03

克百威商品名呋喃丹，是一種廣譜、高效、藥效殘留期長的內吸性殺蟲、殺螨、殺線蟲劑，廣泛應用于蔬菜、水果和糧食作物等的害蟲防治中[1]。因克百威對人和動物有很高的毒性，并且不易降解，容易造成環境污染，我國已規定食品中克百威的最大殘留限量，但違規使用現象仍然較多，因此加強對克百威農藥殘留的檢測十分必要[2-5]。

目前，克百威殘留分析一般使用氣相色譜法（簡稱GC）[6]、高效液相色譜法（簡稱HPLC）[7-8]及色譜質譜聯用技術[9-12]，這些方法靈敏、準確，可以同時測定多種藥物，但樣品前處理復雜、繁瑣費時，且需要昂貴的儀器設備和專業的操作人員，檢測成本高，難以滿足樣品現場、批量、快速檢測的需要。因此，開發一種簡單快速、適用于農藥殘留現場監控的分析方法具有重要意義。本研究基于酶聯免疫吸附技術，建立了一種快速、靈敏的檢測蔬菜、茶葉中克百威殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌性Balb/c小鼠（6～8周齡），清潔級，由北京勤邦生物技術有限公司實驗動物室提供；呋喃酚、碳酰氯、克百威（純度≥99%）、牛血清白蛋白（簡稱BSA）、卵清蛋白（簡稱OVA）均購自Sigma公司；其他化學試劑為國產分析純；樣本提取劑：稱取4.40 g十二水合磷酸氫二鈉和13.68 g二水合磷酸二氫鈉，加入500 mL去離子水，溶解混勻。

1.2 儀器與設備

8010S勻漿機（上海斯伯明儀器設備有限公司）；2000SBL電子天平（美國Setra公司）；KS-Ⅱ振蕩器（上海躍進醫療器械廠）；QL-901漩渦混合器（江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Anke TDL-40B低速離心機（上海安亭科學儀器有限公司）；微量移液器（單道20～200、100～1 000 μL，多道20～300 μL，美國Thermo公司）；DHP-600生化培養箱（天津市中環實驗電爐有限公司）；MK3酶標儀（美國Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 克百威半抗原的合成 合成路線見圖1。取呋喃酚1.0 g，加30 mL二氯甲烷溶解，加入碳酰氯，0～5 ℃反應4 h，加入90 mL石油醚，靜置，底部有油狀物析出，轉入分液漏斗中，分去上層有機相，油狀物加四氫呋喃溶解，然后加入2 mL含有甲胺的四氫呋喃溶液，0～5 ℃反應2 h。停止反應，旋蒸，除去四氫呋喃，得到紅色油狀物，上硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯（20 ∶ 1，體積分數）洗脫分離，得到產物Ⅰ。取鋅粉 1.2 g，加蒸餾水和0.5 mL冰乙酸，80 ℃加熱活化30 min，加入含有產物Ⅰ的乙醇30 mL，60 ℃反應4 h，TCL監測，反應已完全，停止反應，過濾，除去鋅粉。乙醇水溶液蒸干，加水-乙酸乙酯萃取分離，分出有機相水洗干燥，石油醚-乙酸乙酯（30 ∶ 1，體積分數）重結晶，即得到克百威半抗原產物。其化學結構用核磁共振鑒定。

1.3.2 人工抗原的制備 采用碳二亞胺法[13]，將克百威半抗原與牛血清白蛋白和卵清蛋白分別偶聯，作為免疫原和包被原。采用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）法[14-15]測定半抗原與載體蛋白的偶聯比。

1.3.3 單克隆抗體的制備 按照常規方法免疫Balb/c小鼠制備腹水抗體，用飽和硫酸銨法純化后備用[13]。

1.3.4 間接競爭ELISA方法的建立 將包被原包被在96孔酶標板上，100 μL/孔，37 ℃溫育2 h；倒去板中溶液，經PBST洗滌3次，加入封閉液200 μL/孔，37 ℃溫育2 h；洗滌3次，加入系列濃度的克百威標準溶液50 μL/孔和單克隆抗體溶液50 μL/孔，25 ℃避光反應30 min；洗滌4～5次后，加入酶標二抗100 μL/孔，25 ℃避光反應30 min； 洗滌4～5次后加入底物液A液（過氧化脲）和B液（四甲基聯苯胺）各 50 μL/孔，25 ℃顯色15 min，加入2 mol/L H2SO4終止液 50 μL/孔，設定酶標儀于450 nm處測定每孔吸光度。

1.3.5 標準曲線的繪制 采用間接競爭ELISA方法建立標準曲線，分別選擇克百威標準品濃度0.0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L，以濃度為0.0 μg/L時的吸光度為D0值，相應克百威濃度的吸光度為D值，以百分吸光度（D/D0）為縱坐標，標準品濃度的對數值為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.6 樣本前處理方法的建立

1.3.6.1 蔬菜前處理方法 稱取（1.00±0.05）g均質后的蔬菜樣品至10 mL聚苯乙烯離心管中，加入5 mL樣本提取劑，用振蕩器振蕩5 min，混勻，4 000 r/min室溫離心5 min；移取 200 μL 上清液至2 mL聚苯乙烯離心管中，加入600 μL樣本復溶工作液，用渦旋儀渦動2 min，充分混勻；取50 μL用于分析。endprint

1.3.6.2 茶葉前處理方法 稱取1 g茶葉樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入10 mL乙腈，用渦旋儀渦動1 min，混勻，4 000 r/min室溫離心5 min；移取1 mL上層有機相至 10 mL 潔凈干燥的玻璃管中，于20～30 ℃水浴氮氣流下吹干；加入1 mL樣本復溶工作液，用渦旋儀渦動2 min，充分混勻；取50 μL用于分析。

1.3.7 ELISA方法技術性能的評價

1.3.7.1 敏感性試驗 用IC50和檢測限來評價方法的靈敏度。測定20次標準曲線的IC50，統計其平均值和浮動范圍；測定20個空白樣本，求出其D/D0在標準曲線上對應濃度的平均值（x）和標準差（s），方法檢測限MDL=x+3s。

1.3.7.2 準確性和重復性試驗 用回收率和變異系數分別評價ELISA方法的準確性和重復性。以3個不同濃度的克百威標準品分別對空白馬鈴薯、黃瓜、白菜、茶葉樣本進行添加回收試驗，計算回收率和變異系數。

1.3.7.3 特異性試驗 選擇與克百威具有類似結構和類似功能的其他農藥進行交叉反應性檢測。按下式計算交叉反應率：交叉反應率=x/y×100%，式中x為引起50%抑制的克百威濃度，y為引起50%抑制的其他農藥濃度。

2 結果與分析

2.1 半抗原的核磁共振氫譜鑒定

取半抗原產物經核磁共振（nuclear magnetic resonance，簡稱NMR）得圖2。從圖2可得，1H-NMR（CDCl3，300 MHz）δ：8.0（s，1H，—NH—），6.27（s，2H，—NH2），6.19（s，1H，ArH），6.31（s，1H，ArH），2.89（s，2H，—CH2—），2.58（s，3H，—CH3），1.46（s，6H，—CH3）。圖譜中δ=6.27的苯環上芳香胺特征吸收峰的存在，結合其他共振吸收峰的特征，證明克百威半抗原結構正確。

2.2 半抗原與載體蛋白偶聯比的測定

由圖3得曲線公式為y=5.174 2x3-1.554 5x2+0.621 8x-0.004 8，根據公式得BSA抗原（免疫原）的偶聯比=335×（y2-y1），OVA抗原（包被原）的偶聯比=225×（y2-y1）。式中：y2為載體蛋白的氨基濃度，y1為偶聯抗原的氨基濃度。

結果顯示，BSA抗原（免疫原）測定出的吸光度為0.149，BSA測定出的吸光度為0.205，根據公式計算出y1=0.070 452 735，y2=0.101 917 517，偶聯比為335×（y2-y1）=335×（0.101 917 517-0.070 452 735）=10.54；OVA抗原（包被原）測定出的吸光度為0.121，OVA測定出的吸光度為 0.184，根據公式計算出y1=0.056 844 776，y2=0.089 214 748，偶聯比為225×（y2-y1）=225×（0.089 214 748-0.056 844 776）=7.28。

2.3 標準曲線的建立

以百分吸光度（D/D0）為縱坐標（y）、標準品濃度的對數值為橫坐標（x）繪制標準曲線，結果見圖4。以Logit（D/D0）為縱坐標，標準品濃度的對數值為橫坐標，將圖4轉換成圖5后可知，在 0.5～40.5 μg/L濃度范圍內，Logit（D/D0）與克百威濃度對數呈良好的線性關系，建立擬合回歸直線方程為 y=-2.054 0x+0.667 3，相關系數r為0.998 5，半數抑制濃度（IC50）為2.3 μg/L。

2.4 敏感性試驗

統計20次標準曲線的IC50平均值為2.2 μg/L，浮動范圍為1.5～3.0 μg/L；20個空白樣本的D/D0在標準曲線上對應濃度的平均值（x）和標準差（s）見表1。綜合考慮幾種樣本的檢測限數據，本方法對蔬菜樣本的檢測限確定為5 μg/kg，對茶葉樣本的檢測限確定為10 μg/kg。

2.5 準確性和重復性試驗

取空白馬鈴薯、黃瓜、白菜、茶葉樣本，按表2所述的克百威添加濃度對其進行添加回收試驗，每個濃度做5個平行，用3個批次的試劑測定，分別計算回收率和批內、批間變異系數，結果見表2。由表2可知，以3個不同濃度的克百威標準品對空白馬鈴薯、黃瓜、白菜、茶葉樣本進行添加，其添加回收率為79.2%～102.7%，批內變異系數為5.5%～8.1%，批間變異系數為7.7%～11.5%，均小于15%，說明用該ELISA方法測定蔬菜、茶葉中克百威的殘留具有準確性和重復性，可用于蔬菜、茶葉中克百威的殘留測定。

2.6 特異性試驗

選擇氨基甲酸酯類農藥（丁硫克百威、甲萘威、異丙威、速滅威、滅多威、仲丁威）與有機磷類農藥（甲胺磷、久效磷、敵敵畏）進行交叉反應性檢測。結果發現， 選用的克百威單克隆抗體與丁硫克百威有一定的交叉反應（11.8%），這可能是因為克百威作為丁硫克百威的代謝產物，有類似的結構，而對其他農藥的交叉反應率均較低（<1%），表明本方法具有良好的特異性。

3 結論與討論

酶聯免疫法因靈敏度高、特異性好、操作簡便、檢測成本低、一次性檢測樣本量大等特點，能夠更好地滿足我國食品企業、政府監管部門等開展檢測工作。本研究初步建立了蔬菜、茶葉中克百威殘留檢測的酶聯免疫吸附法。該方法的IC50浮動范圍為1.5～3.0 μg/L，對蔬菜樣本的檢測限為5 μg/kg，對茶葉樣本的檢測限為10 μg/kg；樣本添加回收率為 79.2%～102.7%，重復檢測的變異系數為5.5%～11.5%，并且樣本前處理簡單、儀器設備投資少、檢測成本低，適用于大批量樣本中克百威殘留的快速篩選。

參考文獻：

[1]上海交通大學. 克百威農藥的納米膠體金標記免疫測定方法：ZL03116692.X[P]. 2003-04-29.endprint

[2]楊金易，吳 青，王 弘，等. 高親和力的農藥克百威單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 中國農業科學，2007，40（3）：518-523.

[3]劉乾開，朱國念. 新編農藥使用手冊[M]. 上海：上海科學出版社，1999：101-102.

[4]食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量：GB 2763—2014[S]. 北京：中國標準出版社，2014.

[5]劉 剛. 山東省：毒死蜱氧樂果克百威在蔬菜上違規使用現象仍然較多[J]. 農藥市場信息，2015（25）：16.

[6]孫盈盈. 氣相色譜法檢測水產品中呋喃丹的殘留[D]. 武漢：華中農業大學，2013.

[7]Vera-Avila L E，Márquez-Lira B P，Villanueva M，et al. Determination of carbofuran in surface water and biological tissue by sol-gel immunoaffinity extraction and on-line preconcentration/HPLC/UV analysis[J]. Talanta，2012，88：553-560.

[8]韋林洪，劉曙照，邵秀金. 免疫親和色譜-高效液相色譜法測定河水和土壤中克百威、三唑磷和綠磺隆殘留量[J]. 理化檢驗（化學分冊），2012，48（8）：887-892.

[9]張慧麗，王建華，李 馨，等. 氣相色譜串聯質譜法測定蔬菜中甲拌磷和克百威及其代謝物的殘留量[J]. 化學分析計量，2016，25（1）：10-14.

[10]Chowdhury M A Z，Fakhruddin A N M，Islam M N，et al. Detection of the residues of nineteen pesticides in fresh vegetable samples using gas chromatography-mass spectrometry[J]. Food Control，2013，34（2）：457-465.

[11]張 璇，姜 敏，劉 峰，等. 高效液相色譜-質譜聯用儀檢測蘋果中的丁硫克百威和克百威的殘留量[J]. 農藥科學與管理，2015，36（6）：44-48.

[12]Moreno-González D，Huertas-Pérez J F，García-Campa nˇa A M，et al. Determination of carbamates in edible vegetable oils by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry using a new clean-up based on zirconia for QuEChERS methodology[J]. Talanta，2014，128：299-304.

[13]楊利國，胡永昶，魏平華，等. 酶免疫測定技術[M]. 南京：南京大學出版社，1998：139-157，204-211，254-255.

[14]Habeeb A F S A. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid[J]. Analytical Biochemistry，1966，14（3）：328-336.

[15]Sashidhar R B，Capoor A K，Ramana D. Quantitation of ε-amino group using amino acids as reference standards by trinitrobenzene sulfonic acid：a simple spectrophotometric method for the estimation of hapten to carrier protein ratio[J]. Journal of Immunological Methods，1994，167（1/2）：121-127.endprint