南美白對蝦CuZnSOD原核表達及抗體制備

陳曉燕+黃明珠+張妮+劉歡+朱芳芳+熊志偉

摘要：鋅銅超氧化物歧化酶（cytoplasmic copper/zinc superoxide dismutase，CuZnSOD）是超氧化物歧化酶家族的一種，超氧化物歧化酶在動植物的抗氧化和免疫功能中扮演著重要的角色。本研究將南美白對蝦胞外CuZnSOD基因與pet32a表達載體連接，轉化大腸桿菌BL21，IPTG誘導融合表達，經SDS-PAGE分析表明，融合蛋白主要以包涵體形式存在，分子量約為18 ku。利用Ni柱親和純化發(fā)酵產物，得到較單一的蛋白，制備了多克隆抗體。

關鍵詞：胞外CuZnSOD；原核表達；純化；組織分布

中圖分類號： S917 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0193-03

南美白對蝦是當今世界水產養(yǎng)殖產量最高的三大蝦類之一。近年來，日益嚴重的南美白對蝦病害，已對某些區(qū)域造成了毀滅性的打擊，隨著我國南美白對蝦養(yǎng)殖業(yè)的進一步擴大，病原體的變異、新型病原的出現(xiàn)、病害的防控形勢不容樂觀[1]。南美白對蝦病害主要有紅體?。ㄓ址Q“桃拉綜合癥”）、蛻殼綜合癥、固著類纖毛蟲病、白斑病、黑鰓病、弧菌病、亞硫酸鹽中毒癥、應激性反應[2]。其中弧菌病最為猖獗，近年我國的對蝦養(yǎng)殖業(yè)特別是華南地區(qū)的對蝦養(yǎng)殖領域遭受到嚴重的病害肆虐，發(fā)病率及排塘率都在50%以上，個別甚至達到90%。整個疫情中弧菌貫徹始終[3]。

機體在對抗病害、重金屬、環(huán)境等因素脅迫時，會導致負氧離子等氧化自由基（ROS）的產生[4-5]，高濃度的氧化自由基會導致細胞損傷甚至是細胞死亡[6]。高濃度氧化自由基的消除需要依靠包括超氧化物歧化酶（SOD）在內的抗氧化酶系統(tǒng)，SOD能將體內有毒的負氧離子歧化為無毒的氧分子和較低毒性的過氧化氫分子[7]。鋅銅超氧化物歧化酶（cytoplasmic copper/zinc superoxide dismutase，CuZnSOD）是目前發(fā)現(xiàn)的一類主要細胞外的發(fā)揮抗氧化作用的抗氧化酶[8]。南美白對蝦CuZnSOD在蝦體對抗溶藻弧菌和白斑綜合癥病毒脅迫是扮演著重要的角色[9]。本研究將南美白對蝦胞外CuZnSOD基因與pet32a表達載體連接，轉化進入大腸桿菌BL21中并成功表達出融合蛋白。融合蛋白分子量約為 18 ku。利用Ni柱親和純化發(fā)酵產物，制備了多克隆抗體，以期為將來的南美白對蝦胞外CuZnSOD的應用和研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 大腸桿菌Escherichia coli DH5α、E.coli BL21菌株，原核表達載體pet32a，均由江西科技學院護理學院生理實驗室保存，PMD-18T載體購自TaKeRa公司。

1.1.2 試劑 NC膜為Pall Life Science公司產品，Ni NTA填料，Trizol試劑購自Invitrogen公司；弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑為Sigma公司產品；反轉錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit、限制性內切酶、T4 DNA連接酶為TaKaRa公司產品；DNA凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒為Axygen公司產品；預染低分子量蛋白maker為BIO-RAD公司產品；Tryptone，Yeast Extract，peptone為MD Bioscience公司產品；動物蛋白提取試劑盒為上海生工生物有限公司產品；堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG為北京鼎國生物科技有限公司產品。其余為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據GenBank上的南美白對蝦CuZnSOD基因序列（ADM64316.1）設計包含酶切位點的特異性引物，SODs： 5′-GCGAATTCATGAAGACGTTGGCAACTCT

GCTGGCTGTG-3′（包含EcoRⅠ酶切位點、起始密碼子；SODm-x： 5′-GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGGA

ACCCT CTCTCAGTGATGGTGCAGCAGGC-3′（包含XbaⅠ酶切位點、終止密碼子、6×his標簽）擴增CuZnSOD開放性閱讀框（ORF）。引物由深圳華大基因合成。

1.2.2 南美白對蝦肝胰腺RNA提取和cDNA的合成 取肝胰腺液氮冷凍研磨，按照說明書Trizol法提取RNA，按照反轉錄試劑盒說明書文獻[9]合成cDNA。

1.2.3 擴增目的基因 以cDNA為模板，利用設計的特異性引物進行PCR擴增，程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，12 ℃保存。PCR產物跑1%瓊脂糖膠電泳，紫外燈下切膠，采用DNA凝膠回收試劑盒進行回收。

1.2.4 鑒定目的片段 將上述回收的DNA片段與PMD-18T載體連接后，轉化大腸桿菌DH5α，轉化后涂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑陽性克隆進行菌液PCR，送上海生工測序。測序正確的載體命名為PMD-18T-SOD。

1.2.5 表達載體構建 用限制性內切酶EcoRⅠ和XbaⅠ對PMD-18T-SOD和pet32a載體進行雙酶切，酶切產物跑1%瓊脂糖膠電泳，紫外燈下切膠，采用DNA凝膠回收試劑盒進行回收，回收產物按摩爾比1 ∶ 5混合，按比例加入T4 DNA連接酶，4 ℃過夜，轉化DH5α，轉化后涂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑陽性克隆進行菌液PCR，送上海生工測序。測序正確的載體命名為pet32a-SOD。

1.2.6 融合蛋白誘導 將構建的重組表達質粒轉化進入BL21，轉化后涂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑陽性克隆進行菌液PCR驗證。驗證正確的菌株接種于含100 mmol/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min，37 ℃培養(yǎng)至D600 nm為0.4～0.6，加入IPTG，使之終濃度為1 mmol/L，誘導3 h后開始取樣，每隔 1 h 取樣1次，通過跑SDS-PAG蛋白膠檢測蛋白表達情況。endprint

1.2.7 發(fā)酵產物純化 大量發(fā)酵后，收集菌體，磷酸緩沖液重懸，在超聲波下破碎30 min；8 000 r/min 4 ℃離心15 min，棄上清；用含4 mol/L尿素的緩沖液重新溶解，12 000 r/min 4 ℃ 離心20 min，留上清，0.4 μm濾膜過濾；依照Ni-NAT操作手冊進行蛋白純化[9]，跑SDS-PAG蛋白膠檢測蛋白純化情況。

1.2.8 各組織蛋白檢測 重組蛋白溶液（含0.5～1.0 mg重組蛋白）加等體積弗氏完全佐劑，用注射器混勻，多點注射于大白兔腹部及腹股溝，每隔7 d免疫1次，免疫4次后，收集血清[9]。根據動物蛋白提取試劑盒提取南美白對蝦眼柄、鰓、肝胰腺、肌肉、腸、血細胞和心臟的總蛋白，提取的總蛋白分別用Bradford法[10]測定濃度，血清與蝦各組織20 μg總蛋白按照Towbin法[11]做Western Bolt。

2 結果與分析

2.1 目的片段擴增和表達載體構建

以cDNA為模板擴增目的片段，跑1%瓊脂糖凝膠，約 500 bp 處有明顯亮帶，符合預期大小，經測序證明確為CuZnSOD序列（圖1）；雙酶切連接載體后，轉化BL21，擴大培養(yǎng)后，提取質粒，對質粒進行雙酶切驗證，結果顯示有2條亮帶，1條為開環(huán)pet32a，1條約500 bp大小為目的片段，證實構建表達載體成功（圖2）。

2.2 融合蛋白誘導表達及純化

構建好的表達菌株經IPTG誘導表達后，經SDS-PAGE跑膠檢測，以加入IPTG之前菌液為空白對照，經IPTG誘導的菌液在18 ku左右有明顯條帶，與預期大小相符（圖3）；通過Ni柱純化后得到較單一條帶；由圖4可知，發(fā)酵液上清沒有目的蛋白，目的蛋白以包涵體的形式存在；穿透液中仍有少量目的蛋白沒有結合上Ni柱，經結合緩沖液洗掉雜帶后，最后通過剝離洗脫液獲得較純的目的蛋白。

2.3 抗體制備及各組織蛋白相對量檢測

純化蛋白免疫新西蘭白兔后，取血清，用抗體稀釋液與肝胰腺總蛋白進行Western Bolt，結果發(fā)現(xiàn)在18 ku左右有明顯條帶，伴有較多雜帶（圖5）。

3 討論

SOD酶活性在水產養(yǎng)殖領域已經被當作動物免疫活性的一項指標[12-15]。目前，對蝦中MnSOD有較多研究，胞外CuZnSOD只有在南美白對蝦中克隆出基因序列，且CuZnSOD mRNA在血細胞和腸道中表達量最大，在心臟、眼柄和肌肉表達量較少[16]。在蝦受到應激時，肌肉顏色變深，在抗氧化防御中起著重要的作用，可能在血液將CuZnSOD蛋白運輸至肌肉組織時，發(fā)揮抗氧化作用，導致肌肉中mRNA含量低，而蛋白表達量很高。本試驗擴增目的片段過程中所用的特異性引物的下游引物SODm-x中直接人為添加6×his 標簽和終止密碼子，提前終止了表達，這樣就能將pet32a載體上自帶的分子量較大的GST標簽和一些不必要的氨基酸序列連在表達的融合蛋白上，所表達的融合蛋白與源序列更為接近。多克隆抗體具有特異性較低的缺點[17]，制備的兔抗南美白對蝦胞外CuZnSOD多克隆抗體進行抗體特異性檢測時，出現(xiàn)一些雜帶，但是目的條帶相對較明顯，多抗可用于下一步試驗。SOD在工業(yè)和農業(yè)上有大量應用[18]，本試驗中的南美白對蝦胞外CuZnSOD原核表達及產物純化技術為其在工業(yè)及農業(yè)的應用打下了堅實的基礎。

參考文獻：

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