過氧化氫浸種處理對油菜幼苗抗寒生理特性的影響

葉朝軍+萬林+孫繼+金淵博+王怡娟+江海東

摘要：以南農油4號（Brassica napus cv. Nannongyou 4）油菜品種為試驗材料，研究0.05%濃度過氧化氫（H2O2）浸種處理對低溫下油菜幼苗活性氧、抗氧化酶系統和非酶抗氧化劑的影響。結果表明，0.05%濃度過氧化氫浸種能夠有效降低丙二醛（MDA）含量，在脅迫后期（大于3 d），H2O2處理下的油菜葉片H2O2含量和 O-2 · 產生速率均顯著低于對照。抗氧化酶活性的數據表明，H2O2浸種處理能有效提高逆境脅迫下油菜葉片中的抗氧化酶活性，以處理6 d為例，油菜葉片的SOD、POD、CAT活性分別提高了29.8%、21.0%、50.3%；另外，H2O2浸種處理后油菜的AsA、GSH含量，AsA/DHA和GSH/GSSG也有顯著增加。由此可見，過氧化氫浸種處理可緩解低溫對油菜的傷害。

關鍵詞：油菜；過氧化氫；浸種；低溫脅迫；抗氧化系統

中圖分類號： S634.301 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0104-03

油菜是我國長江中下游地區主要的油料作物，其種植面積和總產均居世界首位[1]。近年來，直播油菜以其省工節本的優點受到廣大農民的歡迎。但由于耕作制度的改變或茬口的原因等，往往播種較晚，出苗后容易遭受低溫凍害，引起代謝紊亂而影響油菜生長[2]。因此研究和防治冷害對油菜的影響意義重大。

植物在正常生長情況下，體內活性氧（ROS）的產生與清除處于一種動態平衡。而在低溫脅迫條件下植物體內膜脂過氧化進程加快，ROS的代謝紊亂，積累的ROS會對植物造成毒害作用[3-4]。植物體內清除ROS的系統有抗氧化酶類及非酶抗氧化劑等物質，這些物質協同作用能有效清除ROS，保護膜的完整性，提高植物抗寒性。植物體內的抗氧化系統由小分子抗氧化物和抗氧化酶組成[5]。侯麗霞研究發現用適宜濃度雙氧水（H2O2）噴施油菜葉片提高了油菜的抗寒性[6]。浸種是生產上一種常用的藥劑處理方式，周筱玲研究表明，H2O2浸種能顯著提高油菜種子發芽率[7]。萬林等研究表明，H2O2浸種能有效緩解低溫脅迫對苗期油菜生長的抑制效應[8]。

總體來看，目前H2O2浸種對油菜抗寒生理研究較為薄弱。萬林等試驗在大田進行，溫度波動較大[8]。因此，本試驗以抗寒性品種南農油4號為試驗材料，研究其經過H2O2浸種處理后，苗期油菜在低溫脅迫下葉片中ROS含量、抗氧化酶活性及抗氧化物質含量的變化，以期為油菜的抗寒栽培提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

供試油菜品種為南農油4號（Brassica napus cv. Nannongyou 4）。2013年10月28日，以篩選出的質量濃度為0.05%的H2O2于黑暗下浸泡油菜種子8 h，以去離子水浸種作為對照。浸種完成后用去離子水漂洗3次后晾干，播于規格為7 cm×7 cm×5 cm 的小花盆中，培養基質為沙土（1 ∶ 1混合）。置于（20.0±1.0） ℃/（15.0±1.0） ℃光照培養箱中培養，油菜苗長出真葉時定苗，待油菜長出3張真葉開始進行低溫脅迫。設置光照培養箱內溫度為4.0±1.0 ℃，連續脅迫9 d，每個處理重復3次。測量時，從3個重復處理中選取生長一致的5株幼苗，每株幼苗均以自上而下第3張真葉作為測量對象。

1.2 測定方法

H2O2含量測定參照Moloi等的方法[9]；丙二醛（MDA）含量測定參照Hodges等的方法[10]；超氧陰離子自由基（O-2 · ）產生速率測定參照Elstner等的方法[11]并有所改動。取 0.5 mL 的粗酶液、0.5 mL的65 mmol/L磷酸緩沖液（pH值為7.8）、1 mL的10 mmol/L磺胺和1 mL的7 mmol/L的α-萘胺，搖勻后 25 ℃ 水浴20 min。在530 nm條件下測定其吸光度。超氧化物歧化酶（SOD）活性和過氧化物酶（POD）活性測定參照Tan等的方法[12]；過氧化氫酶（CAT）活性測定主要是參照Chance等的方法[13]并有所修改。0.1 mL酶液加 3 mL CAT反應液（0.075% H2O2溶液1 mL，0.05 mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液1.9 mL），240 nm下比色，每隔30 s讀取吸光度的下降值。抗壞血酸（AsA）及脫氫抗壞血酸（DHA）含量參照Khanna-Chopra等的方法[14]提取測定；谷胱甘肽還原型（GSH）和氧化型（GSSG）含量參照Paradiso等的方法[15]測定。以上測量均在南京農業大學植物生理實驗室測量完成。

1.3 數據分析與作圖

每個測量數據均5次重復，取其平均值。采用Excel 2010作圖，運用SPSS 19.0進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 油菜葉片MDA含量的比較

從圖1可以看出，隨著脅迫時間延長，對照油菜MDA含量呈上升趨勢，而H2O2處理油菜MDA含量呈先降后升的趨勢。在脅迫期間，H2O2處理油菜MDA含量均低于對照。在脅迫3、6、9 d，H2O2處理下MDA含量比對照分別減少了269%、23.7%、11.4%。

2.2 油菜葉片H2O2含量和O-2 · 產生速率的比較

O-2 · 和H2O2是植物體內2類重要的活性氧。圖2顯示，對照和H2O2處理油菜葉片中的 O-2 · 產生速率和H2O2含量均隨脅迫時間的延長而明顯上升。在脅迫初期（3 d時），H2O2處理下的油菜葉片H2O2含量高于對照處理，這可能是由于H2O2浸種處理使油菜提前進入氧化脅迫階段，而在脅迫后期（9 d時），H2O2處理下的油菜葉片H2O2含量和 O-2 · 產生速率均顯著低于對照。

2.3 油菜幼苗SOD、POD、CAT活性比較endprint

SOD、POD和CAT是植物體內重要的3類抗氧化酶。由圖3可以看出，H2O2浸種處理可提高低溫脅迫下這3類酶的活性。與對照相比，在低溫脅迫6 d，油菜葉片的SOD、POD、CAT活性分別提高了29.8%、21.0%、50.3%，說明H2O2浸種處理能有效提高逆境脅迫下油菜葉片中的抗氧化酶活性，從而提高其抗寒性，緩解低溫對油菜的傷害。

2.4 油菜葉片AsA和GSH的比較

AsA和GSH是植物體內重要的抗氧化劑，通過AsA-GSH循環發揮作用。由圖4可以看出，在低溫脅迫期間，AsA含量呈上升趨勢，GSH含量呈先升后降的趨勢。整體而言，H2O2浸種處理的油菜AsA、GSH含量高于對照油菜。在低溫脅迫6 d，H2O2浸種處理的油菜AsA、GSH含量分別比對照高出16.4%、28.7%。

另外，植物體內除氧化態的AsA、GSH外，還存在著還原態的DHA和GSSG。AsA/DHA和GSH/GSSG更能體現植物整體的氧化還原狀況。從圖4可以看出，AsA/DHA、GSH/GSSG的比值均隨脅迫時間的延長先上升后趨于穩定。整體而言，H2O2浸種處理的油菜AsA/DHA和GSH/GSSG均高于對照油菜。在低溫脅迫 9 d，H2O2浸種處理的油菜AsA/DHA和GSH/GSSG分別比對照高出15.6%、15.8%。

3 討論

研究發現，在脅迫初期，H2O2浸種處理的油菜葉片MDA含量和O-2 · 產生速率均下降，而隨著脅迫程度的加重，葉片的MDA含量及ROS水平迅速增加[6]。其變化趨勢說明植物葉片對低溫脅迫有一個適應過程，脅迫程度加重時，植物體內清除ROS的能力下降，植物受到氧化傷害。同時也說明H2O2浸種能在一定程度上有效緩解低溫脅迫下油菜葉片ROS的大量積累，減少膜傷害。徐田軍等的研究結果[16]也證實了該結論。本試驗結果表明，在脅迫3、6、9 d，H2O2處理下MDA的含量比對照分別減少了26.9%、23.7%、 11.4%。另外，在脅迫后期（9 d時），H2O2處理下的油菜葉片H2O2含量和O-2 · 產生速率均顯著低于對照。說明前期H2O2浸種處理可對低溫脅迫下的幼苗后期生長起到一定的保護作用。

植物受到低溫脅迫后，其體內的抗氧化酶系統就會得到加強[17]，這是保護植物不受氧化脅迫的抗逆性機制之一[18]。SOD、POD和CAT作為植物細胞主要的保護酶，協調作用共同清除植物體內活性氧。萬林等研究發現，H2O2浸種處理極大地促進了低溫下油菜葉片中的POD、CAT活性的提高，使得植物體內多余的活性氧被迅速清除，降低了MDA含量，以減少膜傷害[8]；呂軍芬等發現H2O2浸種處理能顯著提高低溫脅迫下西瓜（Citrullus lanatus）葉片的SOD活性[19]。本試驗結果表明，低溫脅迫下油菜葉片的SOD、POD活性呈先升后下降的趨勢，而CAT的活性呈一直下降的趨勢。這可能是由于CAT對低溫脅迫的反應與POD、SOD略有不同，CAT對低溫脅迫比較敏感。與對照相比，H2O2浸種處理顯著提高了油菜幼苗葉片中SOD、POD、CAT活性。結合MDA、H2O2含量，以及O-2 · 產生速率可以推斷，前期（小于3 d）的低溫脅迫是一個抗寒鍛煉的過程。隨著脅迫程度的增強，細胞膜抗氧化系統遭到破壞。

AsA和GSH是植物體內重要的非酶抗氧化劑。在防止細胞膜過氧化、保持細胞膜系統的完整性、延緩細胞的衰老和增強植物抗逆性方面發揮著重要功能[20]。本試驗結果表明，在脅迫初期，AsA含量隨著幼苗的生長而上升，而GSH含量則先升高后下降。H2O2處理的ASA含量均一直顯著高于對照；處理后期（≥6 d時），H2O2處理的GSH含量也顯著高于對照。這說明H2O2浸種能提高ASA、GSH含量，以減輕油菜的膜脂過氧化，增強其耐寒性。這與小麥（Triticum aestivum）[21]、草莓（Fragaria×ananassa）[22]等的研究相一致。

綜上所述，低溫脅迫下，H2O2浸種處理能夠通過降低MDA含量、ROS水平以及提高抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、增加非酶抗氧化劑（AsA、GSH）含量來提高油菜抗寒性，緩解低溫脅迫傷害。盡管本研究沒有涉及外源H2O2處理對油菜后期生長和產量的影響，但外源H2O2處理有助于低溫脅迫下油菜苗期的生長發育，必然可以增加油菜生物量的積累，從而減少低溫造成的產量損失。

參考文獻：

[1]張冬曉. 我國油菜生產的發展與展望[J]. 中國油料作物學報，2001，23（4）：79-81.

[2]周 琴，孫小芳，郭月玲，等. 6-BA和PP333對油菜幼苗抗寒性的影響[J]. 中國油料作物學報，2007，29（3）：286-290.

[3]朱惠霞，孫萬倉，鄧 斌，等. 白菜型冬油菜品種的抗寒性及其生理生化特性[J]. 西北農業學報，2007，16（4）：34-38.

[4]蒲媛媛，孫萬倉. 白菜型冬油菜抗寒性與生理生化特性關系[J]. 分子植物育種，2010，8（2）：335-339.

[5]陳 超. 低溫條件下冬小麥糖代謝和抗氧化活性與耐寒性關系[D]. 哈爾濱：東北農業大學，2014.

[6]侯麗霞. H2O2對低溫下油菜幼苗幾個生理指標的影響[J]. 湖北農業科學，2013，52（21）：5144-5146.

[7]周筱玲. H2O2浸種對油菜種子萌發的影響[J]. 九江師專學報（社會科學版），1997，15（6）：32-35.

[8]萬 林，張 曼，鐘飛燕，等. H2O2浸種對晚播油菜苗期耐寒性的影響[J]. 中國油料作物學報，2015，37（6）：811-819.

[9]Moloi M J，van der Westhuizen A J. The reactive Oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid[J]. Journal of Plant Physiology，2006，163（11）：1118-1125.endprint

[10]Hodges D M，Delong J M，Forney C F，et al. Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds[J]. Planta，1999，207（4）：604-611.

[11]Elstner E F. Mechanisms of oxygen activation in different compartments of plant cells[M]//Pelland E J，Steffen K L. Active oxygen/oxidative stress in plant metabolism. Rockville：American Society of Plant Physiologists，1991：13-25.

[12]Tan W，Liu J，Dai T，et al. Alterations in photosynthesis and antioxidant enzyme activity in winter wheat subjected to post-anthesis water-logging[J]. Photosynthetica，2008，46（1）：21-27.

[13]Chance B，Maehly A C. Assay of catalases and peroxidases[J]. Methods in Enzymology，1955，2：764-775.

[14]Khanna-Chopra R，Selote D S. Acclimation to drought stress generates oxidative stress tolerance in drought-resistant than -susceptible wheat cultivar under field conditions[J]. Environmental and Experimental Botany，2007，60（2）：276-283.

[15]Paradiso A，Berardino R，de Pinto M C，et al. Increase in ascorbate-glutathione metabolism as local and precocious systemic responses induced by cadmium in durum wheat plants[J]. Plant and Cell Physiology，2008，49（3）：362-374.

[16]徐田軍，董志強，蘭宏亮，等. 低溫脅迫下聚糠萘合劑對玉米幼苗光合作用和抗氧化酶活性的影響[J]. 作物學報，2012，38（2）：352-359.

[17]劉玉鳳，李天來，高曉倩. 夜間低溫脅迫對番茄葉片活性氧代謝及AsA-GSH循環的影響[J]. 西北植物學報，2011，31（4）：707-714.

[18]張立軍，宋廣周，白 霜，等. H2O2對不同大豆品種低溫萌發及主要抗氧化酶活性的影響[J]. 大豆科學，2008，27（1）：97-100.

[19]呂軍芬，郁繼華. H2O2浸種對西瓜耐冷性生理生化指標的影響[J]. 甘肅農業科技，2004（4）：30-32.

[20]許 英，陳建華，朱愛國，等. 低溫脅迫下植物響應機理的研究進展[J]. 中國麻業科學，2015（1）：40-49.

[21]郭麗紅，王定康，王德斌，等. 抗壞血酸和谷胱甘肽在小麥幼苗冷激誘導抗冷性中的變化[J]. 昆明學院學報，2007，29（4）：66-68.

[22]羅 婭. 低溫脅迫與鍛煉對草茍生理特性的影響和草每幾丁質酶基因的克隆[D]. 雅安：四川農業大學，2007.endprint