芒果ANS基因的鑒定及與其他植物的比較分析

蓋江濤+黃建峰+黨志國+朱敏+陳華蕊+王鵬+陳業淵

摘要：花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS，EC：1.14.11.19）是花青素合成中的一個關鍵酶。為了鑒定和分析芒果ANS基因，以芒果ANS基因作為研究目標，以擬南芥的ANS基因為參考，通過BLAST方法獲得了番木瓜、金錢橘、甜橙、蘋果、小果野蕉、桃子、葡萄、龍眼、甜櫻桃、棗、石榴、西洋梨、中華獼猴桃、荔枝、無油樟的ANS基因序列，對其進行了系統進化分析、理化性質分析、結構分析等。系統進化分析結果顯示，雙子葉植物與單子葉植物的ANS基因進化樹沒有單獨形成分支，推測在進化過程中ANS基因的分化在雙子葉植物和單子葉植物形成之后；理化性質分析結果顯示，酸性蛋白占97.2%、穩定性蛋白占13.9%，有導肽的蛋白占8.3%，所有蛋白均為無信號肽的親水性蛋白；蛋白二級結構分析結果顯示，α-螺旋、無規則卷曲是主要結構元件。說明芒果ANS基因具有穩定的花青素合成酶結構，并與本試驗中的絕大多數植物ANS基因具有相似的性質。這為進一步研究芒果ANS基因在花青素合成途徑中的作用提供了理論支持。

關鍵詞：芒果；花青素；花青素合成酶；系統進化；同源性；蛋白二級結構

中圖分類號： S667.701 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0043-07

芒果（Mangifera indica Linnaeus）俗稱芒果，是漆樹科（Anacardiaceae）芒果屬（Mangifera Linnaeus）的著名熱帶果樹，因其果肉細膩、風味獨特、營養價值豐富，且具有理氣、健脾、益胃、降低膽固醇、防治心血管疾病、預防乳腺癌等多種功效，深受人們歡迎[1]。芒果果實色澤作為人們挑選芒果的一個重要參考指標，它的形成是一個非常復雜的代謝過程，主要與類胡蘿卜素和花青素代謝途徑有關。花青素（anthocyanin）又稱花色素，是一類決定顏色的重要的天然水溶性色素，屬于黃酮類化合物，廣泛分布于多種植物組織中，是形成植物花、果實等組織顏色的主要色素[2]。花青素的含量在決定植物的花色、葉色、果色和其他經濟器官的色澤及其營養品質方面起著重要作用，還可以起到吸引昆蟲和植食性動物以達到傳播花粉和種子的目的[3-4]。

花青素合成酶（無色花色素雙加氧酶，anthocyanidin synthase，ANS/leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX，EC：114.11.19）是花青素合成途徑末端的一個關鍵酶，通過Fe2+和 2-酮戊二酸離子將無色花青素氧化生成花青素，屬于雙加氧酶家族[5]。因此，可通過上調或抑制ANS基因的表達來改變花青素的含量或成分，從而引起植物花色的變化。ANS （LDOX）最初是從玉米的A2突變體中克隆得到[6]。目前，ANS基因已在擬南芥[7]、荔枝[8]、芒果[9]、龍眼[10]、葡萄[11]、蘋果[12]、越橘[13]、茶樹[14]、棕色棉[15]等多種植物中克隆。

ANS基因的表達水平與花青素累積之間的關系也在多種植物中被研究。游向榮等研究結果表明，龍眼芽軸顏色和ANS基因的表達差異有關[10]。龍眼正常成花的頂芽芽軸萌動時，芽軸顏色變紅，ANS基因正常表達；而發生成花逆轉時，芽軸顏色保持淺黃色，ANS基因下調表達。Honda等在蘋果中發現，5個花青素合成相關基因在果皮著色過程中協同表達，并且其表達水平和花青素含量呈正相關[16]。Salvatierra等研究表明，在草莓果實成熟過程中，花青素合成相關基因的轉錄水平明顯增加，并且其在紅色果實中的表達水平明顯高于白色果實[17]。Li等研究發現，ANS基因表達活性上調，使得桑樹的果實變為紅色[18]。李曉艷等研究發現，越橘從開花到果實成熟的整個發育過程中都能檢測到ANS基因的表達，在成熟果的果皮中，ANS基因的表達量最高；而花色素苷的含量隨著果實的成熟而增高，在越橘成熟果的果皮中，花色素苷的含量最高，與ANS基因表達量的變化一致[13]。研究說明，ANS基因在越橘果實花色素苷形成過程中可能起到調控作用，并具有一定的組織特異性。

本試驗以芒果ANS基因作為研究目標，以已知ANS基因功能的雙子葉植物綱（Dicotyledoneae）十字花科（Brassicaceae）擬南芥[Arabidopsis thaliana （Linnaeus） Heynhold]的ANS基因為參考，依托全基因組數據庫，通過BLAST的方法獲得了雙子葉植物（Dicotyledons）番木瓜科（Caricaceae）番木瓜（Carica papaya Linnaeus），蕓香科（Rutaceae）金錢橘（Citrus clementina Hortulanorum ex Tanaka）、甜橙[Citrus sinensis = C. ×sinensis （Linnaeus） Osbeck]，薔薇科（Rosaceae）蘋果（Malus domestica Borkhausen=Malus pumila Miller）、桃子[Prunus persica （Linnaeus） Batsch= Amygdalus persica Linnaeus]、甜櫻桃[Prunus avium （Linnaeus） Linnaeus = Cerasus avium （Linnaeus） Moench]、西洋梨（Pyrus communis Linnaeus），葡萄科（Vitaceae）葡萄（Vitis vinifera Linnaeus），鼠李科（Rhamnaceae）棗（Ziziphus jujuba Miller），石榴科（Punicaceae）石榴（Punica granatum Linnaeus），獼猴桃科（Actinidiaceae）中華獼猴桃（Actinidia chinensis Planchon），漆樹科芒果，無患子科（Sapindaceae）龍眼（Dimocarpus longan Loureiro）、荔枝（Litchi chinensis Sonnerat），無油樟科（Amborellaceae）無油樟（Amborella trichopoda Baillon），單子葉植物（Monocotyledons）芭蕉科（Musaceae）小果野蕉（Musa acuminata Colla）的ANS基因序列，通過系統進化分析、理化性質分析、結構分析等分析這17種植物ANS基因序列，比較果樹中ANS基因的特性，為分析ANS基因在芒果中的表達特性及其在花青素合成途徑中的作用機制奠定基礎，為推動芒果ANS基因功能研究提供理論支持。endprint

1 材料與方法

1.1 同源性搜索和數據提取

從NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和phytozome V9.1[19]（http：//www.phytozome.net）中搜索得到擬南芥含有花青素合成酶結構域（pfam：cl21496、pfam：cl21672）的序列；從趙志常等文章中獲得芒果ANS蛋白序列[9]。將得到的序列合并，刪除重復序列。以得到的無重復序列集作為探針，通過BLASTP進行同源性搜索，為了防止錯誤丟失與探針相似度低但含有花青素合成酶結構域的序列，搜索的E值設為10，對應的檢索閾值為Pfam數據庫提供的“cut-off ”值。從Kiwifruit Genome Database[20] （http：//bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/download.cgi）中搜索得到中華獼猴桃ANS基因序列，從趙志常等文章中獲得荔枝ANS蛋白序列[8]。合并檢索得到的所有序列，刪除冗余序列和結構域較短的序列，得到芒果、擬南芥、番木瓜、金錢橘、甜橙、蘋果、桃子、甜櫻桃、西洋梨、葡萄、棗、石榴、中華獼猴桃、龍眼、荔枝、小果野蕉、無油樟的ANS蛋白序列，共36條序列，均含有完整的花青素合成酶結構域。

1.2 多序列比對、系統發育分析及物種進化分析

通過MEGA 6.0[21]軟件中的MUSCLE[22]工具進行蛋白質的多序列比對，參數設置為默認值。將比對結果導入Gblocks[23-24]在線服務器中，選擇保守區域進行后續研究，為了獲得更多保守區域位點，選中3個較為寬松的選項（option for a less stringent selection）。調整后的序列使用MrBayes 322[25]進行基于貝葉斯法的系統發育分析，共進行2次獨立運算，每次運行設置2 000 000代，且每次運算使用4條蒙特卡洛-馬爾科夫鏈（Markov chain Monte Carlo，MCMC）進行隨機取樣，冷鏈溫度設置為0.1，在取樣中每1 000代保存1棵樹，共保存2 000棵樹。前20的樹作為burn-in舍棄，其余80的樹用來構建貝葉斯一致樹和后驗概率。生成的貝葉斯一致樹保存為nexus格式，并在Figtree v1.4.0軟件中進行編輯。物種系統進化分析通過在線工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/CommonTree/wwwcmt.cgi）完成。

1.3 蛋白質生物信息學分析

利用CD search （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）[26]進行保守結構域分析，采用ProtParam tool （http：//web.expasy.org/protparam/）[27]在線工具預測分析蛋白質的理化性質，應用TMpred程序（http：//www.ch.embnet.org/software/TMpred-form.html）[28]在線分析來預測蛋白質跨膜區和跨膜方向。用TargetP 1.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）[29]在線預測氨基酸序列導肽，應用signalP 4.1 server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）[30]中完成蛋白質信號肽的預測。亞細胞定位應用Cell-PLoc 2.0 package軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）[31]進行在線分析。二級結構的預測和分析用SOPMA （http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）[32]完成。利用NetPhos 2.0 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）[33]分析編碼蛋白的磷酸化位點。

1.4 擬南芥ANS基因生育期芯片數據表達模式的分析

從Plant Expression Database （http：//www.plexdb.org/）[34]的數據庫中下載擬南芥的RMA文件，提取擬南芥的5條ANS基因AT4G22880.1、AT4G16330.2、AT5G05600.1、AT2G38240.1、AT3G11180.2分別在各生育期組織[下胚軸（7 d）、子葉（7 d）、幼葉（10 d）、成熟葉（17 d）、老葉（35 d）、葉柄（17 d）、種子（8周）、根（7 d）、根（15 d）、根（21 d）、芽（7 d）、莖尖（14 d）、花萼（>21 d）、花瓣（>21 d）、雄蕊（>21 d）、雌蕊（>21 d）、花粉（6周）、花梗（>21 d）]的表達情況，結果用gplots軟件包中的heatmap.2軟件繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 芒果與其他16種植物ANS蛋白的保守結構域分析

利用CD search對36條ANS氨基酸序列進行保守結構域分析，結果顯示所有的ANS蛋白序列包含1個DIOX-N[35]（non-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal，嗎啡合成N-端的非血紅素加氧酶）亞家族結構域和1個2OG-FeII_Oxy[36]（2-oxoglutarate Fe（II） oxygenase，2-酮戊二酸-Fe2+氧化酶）亞家族結構域，具有花色素合成酶家族特征多肽序列，ANS酶通過Fe2+和（2-oxoglutarate）離子將無色花青素氧化生成花青素，屬于雙加氧酶家族。芒果ANS蛋白序列的結構域如圖1，與其他16種植物ANS蛋白的保守結構域一致。endprint

2.2 芒果與其他16種植物ANS蛋白序列的系統進化分析及ANS蛋白質氨基酸基序分析

本試驗得到的36條氨基酸序列中，包含擬南芥5條、番木瓜1條、金錢橘4條、甜橙4條、蘋果3條、小果野蕉4條、桃子3條、葡萄2條、龍眼1條、甜櫻桃1條、棗2條、石榴1條、西洋梨1條、中華獼猴桃1條、芒果1條、荔枝1條、無油樟1條。對36條氨基酸序列進行系統發育分析，選自成一目、一科、一屬的孑遺植物無油樟為外類群，結果（圖2-A）顯示，進化樹分為3支，其中被選為外類群的無油樟科無油樟的ANS基因為單獨一支，其余16種植物的ANS基因分為2支，雙子葉植物與單子葉植物的ANS基因進化樹沒有單獨形成分支，而是互相摻雜在一起，推測在進化過程中ANS基因的分化在雙子葉植物和單子葉植物形成之后。

通過MEME程序在ANS蛋白中識別出10個潛在的保守基序（圖2-B），不同的基序用不同顏色的方框表示。根據這10個基序的分布，可以將36條ANS蛋白分為與進化結果相似的3個亞家族。由圖2-B可以看出，除Prupe|Prupe.3G183300.1外，都有Motif1基序；除Arath|AT4g16330.2與Ambtr|XP_006828895外，都有Motif10。在3個亞家族中，基序的排列順序都高度保守。第Ⅰ亞家族中基序的分布情況：（1）都有Motif6基序；（2）除Musac|GSMUA_Achr11T23830_001外，都有Motif7；（3）除Maldo|MDP0000156478外，都有Motif9；（4）除Arath|AT4G16330.2外，都有Motif8；（5）除Arath|AT4G16330.2、Prupe|Prupe.3G183300.1、Citcl|Ciclev10012063m、Citsi|orange1.1g018466m外，都有Motif3。第Ⅱ亞家族中分布情況：（1）除Musac|GSMUA_Achr5T04080_001外，都有Motif4；（2）除Zizju|XP_015896715、Arath|AT4G22880.1外，都有Motif2；（3）除Manin|ANS外，都有Motif5。在第Ⅲ亞家族中，Ambtr|XP_006828895基序的特征：（1）有絕大多數氨基酸都有的Motif1基序，卻沒有絕大多數氨基酸都有的Motif10；（2）有第Ⅰ亞家族的保守基序Motif8，有第Ⅱ亞家族的保守基序Motif2、Motif4。

2.3 芒果與其他16種植物ANS基因的物種進化分析

將本試驗中選定的17種植物做物種進化分析，結果（圖3）顯示，雙子葉植物綱的植物聚為一大分支，單子葉植物綱的植物為一支，外類群植物為一支。在本研究選取的15種果樹中，同是薔薇科的蘋果、西洋梨、桃子、甜櫻桃聚為一支，同是蕓香科金錢橘和甜橙聚為一支，同是無患子科的龍眼、荔枝聚為一支，說明在物種進化過程中，同綱植物親緣關系更近，不同綱的植物親緣關系較遠。同時，芒果處于金錢橘、甜橙與荔枝、龍眼之間，說明在物種進化過程中，芒果與金錢橘、甜橙、荔枝、龍眼的親緣關系更近，其次是番木瓜，而與蘋果、西洋梨、桃子、甜櫻桃、棗、葡萄、中華獼猴桃親緣關系相對較遠，與小果野蕉的親緣關系最遠。

2.4 芒果與其他16種植物ANS蛋白的理化性質分析

對36條ANS氨基酸序列進行理化性質分析，結果（表1）顯示，除Arath|AT2G38240.1為堿性蛋白（理論pI>7）外，其余蛋白均為酸性蛋白質（理論pI<7），酸性蛋白質占972%；根據Guruprasad方法[37]，除Arath|AT5G05600.1、Citcl|Ciclev10031811m、Maldo|MDP0000156478、Musac|GSMUA_Achr10T00230_001、Ambtr|XP_006828895為穩定性蛋白（不穩定系數<40）外，其余蛋白均為不穩定性蛋白（不穩定系數>40），穩定性蛋白占13.9%；相對分子量除Maldo|MDP0000621569為52841.2外，其余位于36.21～46.16 ku；僅金錢橘Citcl|Ciclev10012063m與甜橙Citsi|NP_001275784、Citsi|orange1.1g018466m基因具有線粒體靶向肽M （mitochondrial targeting peptide，mTP），其余氨基酸序列均沒有導肽，有導肽的蛋白占8.3%；所有蛋白均為親水性蛋白（GRAVY<0）、無信號肽；所有基因亞細胞定位于細胞質中。說明芒果與其他絕大多數植物ANS蛋白具有相似的性質，為非分泌性蛋白，在細胞內進行代謝活動。

2.5 芒果ANS蛋白二級結構分析

蛋白質二級結構是指多肽鏈中有規則重復的構象，限于主鏈原子的局部空間排列，不包括與肽鏈其他區段的相互關系及側鏈構象。常見的二級結構元件有α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規則卷曲4種形式，α-螺旋是蛋白質中最常見的二級結構元件。α-螺旋靠氫鍵維持穩定，在DNA結合基序中有非常重要的作用；β-折疊是由伸展的肽鏈組成，通過位于同一個肽鏈或相鄰肽鏈的另一個酰胺氫和一個肽鍵的羰基氧之間的氫鍵維持；β-轉角連接蛋白質分子中的二級結構（α-螺旋和β-折疊），是肽鏈走向改變的一種非重復多肽區，蛋白質的抗體識別、磷酸化、糖基化和羥基化位點經常出現在轉角；無規則卷曲主要指那些不能被歸入明確的二級結構如折疊片或螺旋的多肽區段，也是明確而穩定的結構，它們受側鏈相互作用的影響很大，經常構成酶活性部位和其他蛋白質特異的功能部位。

應用在線工具SOPMA預測17種植物的ANS氨基酸序列的二級結構（表1），除Arath|AT5G05600.1、Arath|AT3G11180.2、Maldo|MDP0000621569、Maldo|MDP0000156478的主要結構元件是無規則卷曲、β-折疊外，其余蛋白均以α-螺旋、無規則卷曲為主要結構元件。芒果ANS氨基酸序列的二級結構，結果（圖4）顯示，α-螺旋是芒果ANS最大量的結構元件，占43.3%；其余由31.91%的無規則卷曲、15.38%的β-折疊、9.4%的β-轉角組成。說明芒果ANS與本試驗中的絕大多數植物ANS蛋白一樣，具有穩定的花青素合成酶結構，進一步推斷芒果ANS基因可能在花青素代謝途徑中具有重要作用。endprint

2.6 芒果ANS蛋白的磷酸化位點分析

蛋白磷酸化是調節和控制蛋白質活力和功能的基本機制，一般發生在翻譯后修飾；由于氨基酸側鏈加入了1個帶強負電荷的磷酸基團，發生酯化作用，從而改變了蛋白質的構象、活性。因此，蛋白質的磷酸化位點是判斷其功能的特征之一。蛋白質磷酸化作為普遍存在于生物體內的調節方式，其主要發生在絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）殘基側鏈的羥基上。磷酸化位點分析結果表明，芒果ANS基因所編碼的蛋白質含有15個磷酸化位點（圖5），其中Ser 11個、Thr 1個和Tyr 3個。推測芒果ANS蛋白的磷酸化可能與膜融合蛋白通過改變自身構象來轉運金屬離子并轉運至外模蛋白有關，也可能與細胞信號轉導有關。

2.7 擬南芥ANS基因生育期芯片中的表達模式

由于芒果ANS基因的研究目前只限于克隆，在進一步的試驗研究過程中，以期在模式植物的研究成果中得到借鑒作用。現以擬南芥ANS基因生育芯片的表達模式為例，繪制出擬南芥ANS基因家族的表達模式圖，如圖6所示。擬南芥5條ANS基因的表達均表現出明顯的組織特異性：AT4G16330.2基因除在花粉（6周）表達較弱外，其余組織均表達較強；AT5G05600.1基因在成熟葉（17 d）、花萼（>21 d）中表達最強，在花粉（6周）、莖尖（14 d）、幼葉（10 d）、芽（7 d）、下胚軸（7 d）、花梗（>21 d）表達較弱，其余組織均表達較強；AT2G38240.1基因在雄蕊（>21 d）表達較強，在花瓣（>21 d）、成熟葉 （17 d）、葉柄（17 d）表達較弱，其余組織均無表達；AT4G22880.1在老葉（35 d）中表達最強，在種子（8周）、老葉（35 d）、芽（7 d）、下胚軸（7 d）、子葉（7 d）、成熟葉（17 d）中表達較弱，其余組織均無表達；AT3G11180.2除在花粉（6周）、種子（8周）中有較強表達外，其余組織均無表達。

3 討論

ANS基因作為花青素合成途徑中的關鍵基因，廣泛用于植物基因工程研究。本試驗以芒果ANS基因作為研究目標，以擬南芥ANS基因為參考，對芒果、擬南芥、番木瓜、金錢橘、甜橙、蘋果、桃子、甜櫻桃、西洋梨、葡萄、棗、石榴、中華獼猴桃、龍眼、荔枝、小果野蕉和無油樟17種植物共36條ANS基因編碼蛋白進行了系統發育分析、理化性質分析、結構分析等。

系統發育分析結果顯示，系統進化樹中被選為外類群的雙子葉植物綱無油樟科無油樟為單獨一支，雙子葉植物與單子葉植物的ANS基因互相摻雜在一起，ANS基因進化樹沒有將雙子葉植物與單子葉植物分開，與植物物種之間的親緣關系及進化關系不一致，推測在進化過程中ANS基因的分化在雙子葉植物和單子葉植物形成之后。

理化性質分析結果顯示，所有蛋白中，酸性蛋白占972%、穩定性蛋白占13.9%，有導肽的蛋白占8.3%，所有蛋白均為無信號肽的親水性蛋白。通過蛋白質導肽分析可知，僅金錢橘基因Citcl|Ciclev10012063m與甜橙基因 Citsi|NP_001275784、Citsi|orange1.1g018466m具有線粒體靶向肽M （mTP）外，其余氨基酸序列均沒有導肽。芒果ANS蛋白與其他植物ANS蛋白表現出相似的性質，為酸性、無信號肽、無導肽的不穩定親水性蛋白，是一種非分泌性蛋白，由游離核糖體合成，參與細胞內生化反應，在細胞內代謝過程中發揮重要作用。這與亞細胞定位于細胞質中的結果一致，也與花色素苷的合成主要在細胞質中完成一致。

結構分析結果顯示，芒果ANS蛋白與其他蛋白序列都包含1個DIOX-N亞家族結構域和1個2OG-FeII_Oxy亞家族結構域，具有花色素合成酶家族特征多肽序列，屬于雙加氧酶家族，具有ANS基因家族的特征結構；芒果蛋白二級結構與大多數蛋白一樣，以α-螺旋、無規則卷曲為主要結構元件，具有穩定的花青素合成酶結構，進一步推斷芒果ANS基因可能在花青素代謝途徑中具有重要作用。

蛋白磷酸化位點分析表明，芒果ANS蛋白存在15個磷酸化位點。一般來說，多肽鏈中的氨基酸潛在的磷酸化位點越多，發揮更多功能的可能性就越大。芒果ANS蛋白的磷酸化可能與膜融合蛋白通過改變自身構象來轉運金屬離子并轉運至外模蛋白有關，也可能與細胞信號轉導有關，磷酸化在該蛋白上的具體功能還有待進一步驗證。

模式植物擬南芥ANS基因生育期芯片表達模式分析結果表明，5條基因的表達差異較大，表現出明顯的組織特異性。以擬南芥的ANS基因為參考，以期對研究芒果ANS基因的表達、功能具有借鑒作用。

目前，雖有關于芒果中ANS基因的研究，但主要是對單個基因的克隆及生化特性的研究[9]。本研究以不同植物ANS基因具有較高的同源性為依據，選取17個物種（包括15種果樹、1種模式植物、1種系統發育樹選為外類群的植物），比較了芒果與其他植物中ANS基因的特性，具有更強的針對性和借鑒性。研究結果得出，芒果ANS蛋白性質與其他植物ANS蛋白表現出高度相似性，芒果ANS基因具有ANS基因家族特征，推測芒果ANS基因與其他植物起著相同或相似的生物學功能，但還需進一步的實驗驗證。本試驗對進一步研究芒果ANS基因的時空表達特性及在花青素合成途徑中的作用機制提供理論支持。

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