翹嘴鱖病原嗜水氣單胞菌分子特征及LAMP檢測方法的建立

張 悅 高曉建 葉金明 陳 楠 杜雪地 張曉君 邴旭文

(1. 揚州大學動物科學與技術學院, 揚州 225009; 2. 揚州市水產生產技術指導站, 揚州 225101; 3. 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心, 農業部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室, 無錫 214081)

翹嘴鱖病原嗜水氣單胞菌分子特征及LAMP檢測方法的建立

張 悅1高曉建1葉金明2陳 楠1杜雪地1張曉君1邴旭文3

(1. 揚州大學動物科學與技術學院, 揚州 225009; 2. 揚州市水產生產技術指導站, 揚州 225101; 3. 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心, 農業部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室, 無錫 214081)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種危害鱖魚養殖生產的重要病原細菌, 為進一步明確該病原菌的分子特征及建立快速檢測技術, 實驗對引起翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)暴發性死亡的病原嗜水氣單胞菌進行了致病性、菌株毒力特征研究, 同時以嗜水氣單胞菌氣溶素基因aerA為分子靶標設計引物, 利用環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立了病原嗜水氣單胞菌的快速檢測方法。結果表明, 本次引起翹嘴鱖暴發性死亡的病原嗜水氣單胞菌半致死濃度為1.6×106CFU/mL, 攜帶aerA等14種毒力基因, 此14種毒力基因可用于其致病性分析及分子檢測。以氣溶素基因aerA設計引物進行的環介導恒溫擴增, 結果顯示可擴增出階梯狀條帶, 加入SYBR Green I染色后呈現綠色的陽性反應, 而對照組均未出現任何擴增條帶且反應體系呈現橙色, 表明LAMP檢測方法對于嗜水氣單胞菌檢測具有很好的特異性; 靈敏度檢測的最低檢測限為4.6×101CFU/mL; 10種經人工感染的淡水養殖魚蝦組織勻漿增菌液, 提取DNA后進行LAMP方法檢測, 結果均可獲得陽性擴增結果, 而對照未染菌組呈陰性, 表明該方法具有較好的應用性, 可應用于嗜水氣單胞菌引起的水生動物疾病的檢測。

翹嘴鱖; 嗜水氣單胞菌;aerA基因; 環介導等溫擴增(LAMP)

翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)是淡水兇猛肉食性魚類, 生長速度快, 因其肉質細嫩、營養含量高而深受歡迎, 目前鱖養殖已成為我國水產養殖業一大特色, 但日益嚴重發生的鱖病害問題, 已然成為制約其發展的不利因素之一。目前鱖發生的病害除傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)病導致鱖大批死亡外, 細菌引起的敗血癥病害也較為嚴重, 敗血癥暴發的高峰時期為每年季節交替時段, 該病會造成大批鱖發病死亡, 給養殖戶帶來巨大的經濟損失[1,2]。

近年來江蘇揚州地區多家養殖場養殖的翹嘴鱖出現暴發性死亡, 病魚通常表現為鰓蓋出血, 鰓絲腐爛裂開, 部分病魚鰓部黏液較多、附有大量污泥, 鰓絲末端腐爛; 解剖之后發現肝臟出血, 有腹水;病魚肝臟、脾臟、腎臟腫大, 脾臟常呈紫黑色; 鰾壁充血, 膽囊腫大, 腸系膜、腹膜及腸壁充血, 腸內沒有食物、有較多黏液, 有的腸腔內積水或有氣體、腸管粗脹。經調查及對病魚的檢驗排除了病毒和寄生蟲感染, 經過對患病翹嘴鱖病原菌的分離、形態特征、理化特性、16S rRNA和gyrB基因序列的同源性分析及致病性檢驗, 確定該病原為致病性嗜水氣單胞菌, 分離菌對翹嘴鱖的半致死濃度為1.6×106CFU/mL, 且攜帶aerA等14種毒力基因。實驗以嗜水氣單胞菌的氣溶素基因aerA序列設計LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)引物, 建立針對嗜水氣單胞菌的LAMP檢測方法, 并分析了其特異性, 靈敏性和實際應用性, 該實驗為診斷由嗜水氣單胞菌引起的病害提供了快速的可行性的方法。

1 材料與方法

1.1 分離菌致病性檢測

將分離自患病翹嘴鱖的供試病原嗜水氣單胞菌菌株(G3)接種于普通營養肉湯, 28℃過夜培養后作為供試菌液, 菌液稀釋10倍濃度, 分別為2.8×108、2.8×107、2.8×106、2.8×105和2.8×104CFU/mL,經肌肉注射的方法感染培養一周的健康的翹嘴鱖,每個實驗組各10尾, 每尾接種0.1 mL; 對照組接種同劑量無菌營養肉湯; 于試驗水族箱中隔離養殖,觀察記錄試驗魚感染后每天的發病與死亡情況, 測定分離菌對翹嘴鱖的半致死濃度,LD50計算參考張慶萍等[3]方法進行。

1.2 分離菌毒力基因檢測

細菌模板DNA的制備按煮沸法提取: 取1 mL菌液(供試菌株接種在營養肉湯培養基中過夜培養至對數期)離心1min (12000 r/min), 棄上清, 將菌體懸浮于100 μL的滅菌蒸餾水中, 100℃煮沸10min,冰浴中冷卻后離心10min (12000 r/min), 取上清作為PCR模板。

根據已報道的嗜水氣單胞菌的毒力基因, 選擇氣溶素基因(aerA)等14種毒力基因, 引物由上海生物工程技術公司合成(表1), 用以檢測分離菌毒力基因的攜帶情況。PCR反應體系: 2×EasyTaqPCR SuperMix (北京全式金生物技術有限公司) 12.5 μL,上下游引物各0.5 μL, 模版1 μL, 最后加ddH2O至25 μL。PCR程序如下: 94℃ 5min、94℃ 30s、50—60℃ 30s、72℃ 2min, 循環30次后72℃ 延伸7min。用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析, 采用凝膠成像系統觀察并記錄結果。

1.3 嗜水氣單胞菌LAMP檢測

供試菌株分離自發病翹嘴鱖的供試嗜水氣單胞菌G3, 對照副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)、維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)、非O1霍亂弧菌(non-O1Vibrio cholerae)、愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)均分離自發病水生動物, 本實驗室保存供用, 菌株編號及在GenBank登錄號見表2。

LAMP引物設計與合成用引物設計軟件primer premier5.0和primer explorer V4, 以氣溶素基因(aerA)為靶基因(EU484343)設計嗜水氣單胞菌LAMP特異性引物(表3), 引物由上海生物工程技術公司。

LAMP擴增條件的優化及特異性檢測以一對外引物(Ah-aerA-F3與Ah-aerA-B3)和一對內引物(Ah-aerA-FIP與Ah-aerA-BIP) 對模板進行恒溫擴增, 優化嗜水單胞菌LAMP最佳反應體系。以副溶血弧菌、鰻弧菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、非O1霍亂弧菌及愛德華氏菌為對照菌株, 檢驗內外引物LAMP擴增的特異性, 通過凝膠電泳觀察實驗結果。將反應產物加入1 μL SYBR Green I熒光染料后, 輕輕振蕩, 觀察混合液有無顏色變化。

表1 PCR擴增產物引物Tab. 1 The PCR amplification primers

嗜水氣單胞菌LAMP擴增的靈敏性檢測菌液稀釋法將菌液進行10倍比梯度稀釋為: 4.6×1010、4.6×109、4.6×108、4.6×107、4.6×106、4.6×105、4.6×104、4.6×103、4.6×102、4.6×101和4.6×100CFU/mL。取1 mL菌液按上述煮沸法提取DNA作為LAMP擴增的模板, 陰性對照為滅菌去離子水。按照所建立的LAMP檢測方法進行靈敏性檢測。

嗜水氣單胞菌LAMP檢測的應用取南美白對蝦、羅氏沼蝦、羅非魚、白鰱、鯽、草魚、鯉、泥鰍、黃顙魚、團頭魴等10種淡水養殖魚蝦,進行肌肉組織勻漿, 人工染菌后用營養肉湯培養4h,煮沸法提取DNA, 按優化的LAMP方法進行檢測。通過瓊脂糖凝膠電泳及添加熒光染料SYBR GreenⅠ以檢測結果。

2 結果

2.1 供試菌致病性及LD50

供試菌株(G3)肌肉注射感染健康翹嘴鱖, 感染數小時后翹嘴鱖表現為反應遲鈍, 鰓部出血, 肝臟、脾臟腫大出血, 且出現體表出血及腹水等病變,然后陸續死亡, 死亡情況見表4; G3對翹嘴鱖的LD50為1.6×106CFU/mL; 對感染死亡的翹嘴鱖進行細菌學檢驗, 分離檢驗到其含有大量原感染菌, 表明該分離菌為引起翹嘴鱖大量死亡的病原菌。

2.2 嗜水氣單胞菌毒力基因檢測結果

經PCR檢測該菌株可以擴增出aerA(280 bp)等14個毒力基因。圖1為選擇的代表菌株G3菌株的14種毒力基因檢測結果。

表2 供試菌株來源Tab. 2 Origin of strains used in the study

表3 引物序列Tab. 3 Sequence of primers

表4 分離菌(G3)的致病性Tab. 4 Pathogenicity of isolates (G3)

2.3 嗜水氣單胞菌LAMP檢測方法的建立

經過優化之后的 25 μL LAMP反應體系包括dNTP 2.5 μL (10 mmol/L)、10×Thermopol buffer 2.5 μL、甜菜堿4 μL (5 mol/L)、Mg2+2 μL (25 mmol/L), 引物FIP、BIP各2 μL (10 μmol/L), F3、B3各0.5 μL (10 μmol/L)、Bst DNA酶1 μL (8000U)、DNA模板2 μL, ddH2O補足至25 μL; LAMP的反應條件即在65℃條件下保持60min, 之后80℃終止反應10min。

2.4 嗜水氣單胞菌LAMP檢測的特異性擴增結果

應用上述反應程序, 以一對外引物(Ah-aerAF3與Ah-aerA-B3)和一對內引物(Ah-aerA-FIP與AhaerA-BIP)分別對嗜水氣單胞菌和6株對照致病菌進行LAMP擴增, 結果顯示嗜水氣單胞菌可擴增出階梯狀條帶且經SYBR Green I染色后呈現綠色的陽性反應, 而其他6株對照病原菌均未出現任何擴增條帶且經SYBR Green I染色后呈現橙色的陰性反應(圖2、圖3), 該結果表明所建立的嗜水氣單胞菌LAMP檢測方法特異性較強。

2.5 嗜水氣單胞菌LAMP檢測的靈敏度

10倍系列稀釋嗜水氣單胞菌液提取DNA后, 按2.3建立的LAMP檢測方法進行靈敏性檢測, 結果表明嗜水氣單胞菌菌體濃度自4.6×1010至4.6×101CFU/mL結果顯示可擴增出階梯狀條帶(圖4), 加入SYBR Green I染色后呈現綠色的陽性反應, 而對照組均未出現任何擴增條帶且反應體系呈現橙色(圖5)。本實驗建立的LAMP檢測嗜水氣單胞菌靈敏度為4.6×101CFU/mL。

圖1 嗜水氣單胞菌毒力基因PCR擴增結果Fig. 1 The result of virulence genes of A. hydrophila by PCR amplification

圖2 嗜水氣單胞菌LAMP檢測方法的特異性(電泳)Fig. 2 Specificity of LAMP for detection of A. hydrophila(electrophoresis)

圖3 嗜水氣單胞菌LAMP檢測方法的特異性(SYBR Green I)Fig. 3 Specificity of LAMP for detection of A. hydrophila (SYBR Green I)

圖4 嗜水氣單胞菌LAMP檢測方法的靈敏性(電泳)Fig. 4 Sensitivity of LAMP methods for detection of A.hydrophila (electrophoresis)

2.6 嗜水氣單胞菌LAMP檢測應用

人工染菌的10種水產品組織勻漿增菌液, 提取其DNA后進行LAMP檢測。LAMP檢測電泳結果顯示人工染菌組均呈現階梯狀條帶, 結果為陽性。對照組未染菌組均無電泳條帶(圖6), 加入SYBR GreenⅠ染色后，人工染菌組呈現綠色的陽性反應,而對照組呈現橙色的陰性反應(圖7)， 結果表明所建立的LAMP檢測方法準確測出感染的嗜水氣單胞菌樣品。

圖5 嗜水氣單胞菌LAMP檢測方法的靈敏性(SYBR Green I)Fig. 5 Sensitivity of LAMP methods for detection of A.hydrophila (SYBR Green I)

圖6 嗜水氣單胞菌的LAMP檢測應用(電泳)Fig. 6 Application of LAMP for detection of A. hydrophila(electrophoresis)

圖7 嗜水氣單胞菌的LAMP檢測應用(SYBR Green I)Fig. 7 Application of LAMP for detection of A. hydrophila(SYBR Green I)

3 討論

嗜水氣單胞菌隸屬于弧菌科、氣單胞菌屬, 是水產動物細菌性疾病的重要病原菌之一[13], 該菌近年來已發展成為能夠引起多種水生動物感染的細菌性傳染病原, 可引起鰱、鳙、團頭魴、鳊、鯪、鰻、銀鯽、異育銀鯽、草魚及鱖等多種淡水養殖魚類發生細菌性敗血癥[14], 該菌引起的疾病在我國養魚史上被記載為危害魚的年齡范圍最大(從夏花魚種至食用魚)、危害魚的種類最多、流行地區范圍最廣、造成的損失最大的一種魚類細菌性病害[15], 造成了水產養殖業的巨大損失; 同時, 該菌為典型的人、畜、魚共患病原菌[16]。

自然界中嗜水氣單胞菌分布廣泛, 且對水產養殖動物危害極大[17]。本文從病變的具有典型癥狀的鱖進行病原菌的分離, 從瀕死的鱖的肝臟、腎臟組織中分離到大量優勢菌, 經純化培養, 證實為同一種菌。人工感染實驗結果表明嗜水氣單胞菌具有較強的致病性, 本文對細菌的16S rRNA和gyrB基因序列進行了系統發育學分析, 運用MEGA軟件進行系統進化樹構建, 結果顯示分離菌株與嗜水氣單胞菌具有很高的同源性, 經形態特征、理化特性、16S rRNA和gyrB基因序列的同源性分析及致病性檢驗, 均表明引起翹嘴鱖暴發性死亡的病原為嗜水氣單胞菌。

嗜水氣單胞菌有非致病性菌株和致病性菌株之分, 其中后者又可分為強毒株和弱毒株, 而嗜水氣單胞菌的致病力大小與菌株所攜帶毒力基因有關[18]。嗜水氣單胞菌眾多的毒力基因是否在同一種毒力菌株中全部存在, 或者只有幾種存在并發生作用, 均需要進一步研究明確。溶血素、細胞毒性腸毒素、氣溶素、細胞興奮性腸毒素和胞外蛋白酶等被認為是嗜水氣單胞菌主要致病性毒力基因,這些毒素有較強的毒性, 是導致機體組織出現潰瘍、出血、壞死問題發生的直接原因之一。朱大玲等[19]報道aer和ahp基因與嗜水氣單胞菌的毒力存在相關性, 攜帶aer和ahp基因的菌株可能是強毒株。本研究PCR檢測的毒力基因包括aer和ahp兩種毒力基因, 同時也檢測到lip、act、fla、alt、hly、gcaT、eprCAI、ast、lafA、acg、ela和ompAI等毒力基因, 表明分離株攜帶嗜水氣單胞菌的主要毒力基因。致病性試驗中2.8×107CFU/mL濃度的分離株菌液腹腔感染鱖, 48h內鱖全部死亡, 表明該分離株具有很強的致病性。通過毒力基因檢測和致病性試驗表明溶血素、細胞性腸毒素、氣溶素、細胞興奮性腸毒素等毒力因子為嗜水氣單胞菌主要的毒力因子, 且攜帶這些毒力基因的菌株能夠引起疾病的暴發性流行。

本文以為嗜水氣單胞菌氣溶素基因aerA為靶基因設計了LAMP檢測的4對的特異性引物即2對內引物與2對外引物來識別靶基因的6個特定區域,通過特異性、靈敏性及實際應用情況, 建立了病原嗜水氣單胞菌的LAMP檢測方法。通過瓊脂糖凝膠電泳, 觀察到產生各種片斷長度的莖環結構的擴增產物, 加入SYBR Green I染色后呈現綠色的陽性反應, 而對照組均未出現任何擴增條帶且反應體系呈現橙色, 該方法可用于病原嗜水氣單胞菌的檢驗。由于LAMP擴增的陽性反應呈現smear和一些低分子質量的帶, 一旦產生非特異性擴增, 便不易鑒別, 因此檢測過程應注意外源性DNA污染問題,避免出現假陽性結果, 關注反應的特異性。在分子流行病研究中, LAMP技術相較于PCR法, 它不需要昂貴的PCR熱循環儀, 只需要普通的水浴鍋或者穩定熱源設備即可, 該方法操作簡便、耗時短, 非常適用于水生動物疫病即時、現場、快速檢測病原體的要求。

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MOLECULAR CHARACTERIZATION AND ESTABLISHMENT OF LAMP DETECTION METHOD OF PATHOGENIC AEROMONAS HYDROPHILA ISOLATED FROM SINIPERCA CHUATSI

ZHANG Yue1, GAO Xiao-Jian1, YE Jin-Ming2, CHEN Nan1, DU Xue-Di1, ZHANG Xiao-Jun1and BING Xu-Wen3
(1. College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2. Yangzhou Aquatic Product Technical Guidance Station, Yangzhou 225101, China; 3. Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Utilization,Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China)

Aeromonas hydrophilaexists in the water body, which can cause many kinds of diseases and huge loss of aquaculture animals to the aquaculture production. The pathogenicity and virulence characteristics of the isolated strain which caused mass mortalities of reared Mandarin fish were studied. The rapid detection methods ofA. hydrophilawere established by the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) usingaerAgene as molecular marker. The results showed that theLD50ofA. hydrophilawas 1.6×106CFU/mL, and 14 virulence genes were detected from the isolated strain, which can be biology markers in detecting of pathogenicA. hydrophila. The assay of LAMP for detectingA. hydrophilawas established usingaerAgene as molecular marker. Positive reactions were detected by the stair-step amplified bands, and the green amplified products were observed directly by naked-eye in the reaction tube by addition of SYBR Green I. No any amplified bands and orange color were detected in control group. The results showed that LAMP detection method ofA. hydrophilahad good specificity. The results of sensitivity of LAMP showed that the primers could detectA. hydrophilaat the level of 4.6×101CFU/mL. The artificially infected 10 species of freshwater fishes and shrimps revealed positive amplified results using LAMP detection method, and no-infected 10 samples revealed negative amplified results. The results showed that the LAMP detection method has preferable application, and could be used in rapid diagnose of aquatic animal diseases caused byA. hydrophila.

Siniperca chuatsi;Aeromonas hydrophila;aerAgene; Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)

S941.42

A

1000-3207(2017)06-1225-07

2017-01-03;

2017-04-26

江蘇省水產三項工程項目(Y2016-33和D2015-15); 江蘇省高校自然科學研究重大項目(14KJA240001); 江蘇省重點研發計劃項目(BE2017311)資助 [Supported by the Projects of Shui Chan San Xiang of Jiangsu Province (Y2016-33, D2015-15); the Major Natural Science Research Program of Jiangsu Higher Education Institutions (14KJA240001); the Key Research and Development Program of Jiangsu Province (BE2017311)]

張悅(1994—), 女, 江蘇南京人; 碩士研究生; 主要從事水產動物病害及病原微生物學研究。E-mail: 18861339319@163.com

張曉君, E-mail: zxj9307@163.com; 邴旭文, E-mail: bingxw@ffrc.cn