椰子殼揮發(fā)油對心肌損傷大鼠生物化學(xué)標(biāo)志物的影響及分析※

高秀娟 張廣增 姚榮妹 高 筠 包巨太

(華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 唐山 063210)

椰子殼揮發(fā)油對心肌損傷大鼠生物化學(xué)標(biāo)志物的影響及分析※

高秀娟 張廣增1姚榮妹△高 筠 包巨太2

(華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 唐山 063210)

目的觀察椰子殼揮發(fā)油對急性心肌損傷大鼠生物化學(xué)標(biāo)志物的影響。方法將肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖正常的40只雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為4組，即正常組、模型組、椰子殼揮發(fā)油組、復(fù)方丹參滴丸組，每組10只，連續(xù)給藥7 d，在實(shí)驗(yàn)的第6、7 d，除正常組外，各組大鼠頸部皮下注射鹽酸異丙腎上腺素，建立急性心肌損傷模型。實(shí)驗(yàn)第8 d檢測各組大鼠血清和心肌組織中以下心肌損傷標(biāo)志物的含量：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、α-羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)、血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、乳酸脫氫酶同工酶1(LDH1)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、肌紅蛋白(Mb)。結(jié)果與正常組比較，模型組大鼠血清中AST、CK、CK-MB、LDH、LDH1、α-HBDH、cTnT、cTnI、Mb升高(Plt;0.01)，復(fù)方丹參滴丸組大鼠血清中CK-MB、LDH、LDH1、α-HBDH、cTnI升高(Plt;0.01，Plt;0.05)，椰子殼揮發(fā)油組大鼠血清中AST、CK-MB、LDH、LDH1、α-HBDH、cTnI升高(Plt;0.01，Plt;0.05)。與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸組大鼠血清中AST、CK、CK-MB、LDH、LDH1、α-HBDH、cTnT、cTnI、Mb降低(Plt;0.01)，椰子殼揮發(fā)油組大鼠血清中CK、CK-MB、LDH、LDH1、α-HBDH、cTnT、cTnI、Mb降低(Plt;0.01)。與復(fù)方丹參滴丸組比較，椰子殼揮發(fā)油組大鼠血清中AST、LDH升高(Plt;0.01)。與正常組比較，模型組心肌組織中AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH、cTnT、cTnI、Mb升高(Plt;0.01)，復(fù)方丹參滴丸組心肌組織中AST、CK-MB、α-HBDH升高(Plt;0.01)，椰子殼揮發(fā)油組心肌組織中AST、CK、CK-MB、α-HBDH升高(Plt;0.01，Plt;0.05)。與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸組、椰子殼揮發(fā)油組心肌組織中AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH、cTnT、cTnI、Mb均降低(Plt;0.01)。與復(fù)方丹參滴丸組比較，椰子殼揮發(fā)油組心肌組織中Mb降低(Plt;0.01)。結(jié)論椰子殼揮發(fā)油可以降低心肌損傷時(shí)多種酶類、蛋白質(zhì)類標(biāo)志物的釋放，在一定程度上抑制心肌損傷的發(fā)生。

椰子；心肌疾病；Wistar大鼠；生物學(xué)標(biāo)記；中藥藥理學(xué)

椰子為棕櫚科椰子屬，在我國種植廣泛，現(xiàn)主要集中分布于海南各地、臺灣南部、廣東雷州半島和云南西雙版納，是一種藥食同源的植物。椰子殼含有揮發(fā)油，具有很高的藥用價(jià)值，可用來治療治療筋骨疼痛、咳喘、皮膚病、心臟病等多種疾病[1]。我們在前期臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，從椰子殼中提取的揮發(fā)油具有較好的改善心肌損傷的作用，但其作用機(jī)制尚不明確，因此我們從能夠特異和敏感地反映心肌損傷的生物化學(xué)標(biāo)志物入手，初步探討其抗心肌損傷的作用機(jī)制，為椰子殼揮發(fā)油進(jìn)一步臨床應(yīng)用和中藥新藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SLXK(京)2009-0004，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 藥品 椰子，購買于河北省唐山市果品批發(fā)市場，經(jīng)華北理工大學(xué)藥學(xué)院呂立勛副教授鑒定為棕櫚科植物椰子的果實(shí)，椰子殼揮發(fā)油由華北理工大學(xué)藥學(xué)院制備(制備方法：水蒸氣蒸餾法。將椰子殼陰干，粉碎，稱取粗粉，加8倍量蒸餾水，水蒸汽蒸餾5 h，蒸餾結(jié)束后將燒瓶及導(dǎo)管裝置自然冷卻至室溫，收集揮發(fā)油，無水硫酸鈉除水，4 ℃避光保存。采用揮發(fā)油測定法進(jìn)行檢測，得油率約為0.45%。鹽酸異丙腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H31021344)；復(fù)方丹參滴丸(天士力制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10950111)。

1.1.3 試劑 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，生產(chǎn)批號110861)；α-羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，生產(chǎn)批號110241)；血清肌酸激酶(CK)試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號20110503)；肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號20110402)；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號20110609)；乳酸脫氫酶同工酶1(LDH1)試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號20110502)；心肌肌鈣蛋白T(cTnT)試劑盒(上海百沃科貿(mào)有限公司，生產(chǎn)批號BV-E12121503)；心肌肌鈣蛋白I(cTnI)試劑盒(上海百沃科貿(mào)有限公司，生產(chǎn)批號BV-E12121501)；肌紅蛋白(Mb)試劑盒(上海百沃科貿(mào)有限公司，生產(chǎn)批號BV-E12121502)。

1.1.4 儀器 電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司，型號：98-1-B)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-5205)；臺式低溫離心機(jī)(德國賽默飛世爾科技有限公司，型號：ST40)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號：GZX-9070 MBE)；多導(dǎo)生理記錄儀(美國BIOPAC公司，型號：MP150)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司，型號：HH-6)；自動酶聯(lián)免疫測定儀(美國Bio-Rad公司，型號：Bio-Rad3550)；全自動生化分析儀(意大利AMS公司，SABA18型)；霧化器(德國百瑞公司，型號：085G1005)；電子天平(上海第二天平儀器廠，MP200A型)。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 Wistar大鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，用生理記錄儀測大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖，ST段接近等電位線，T波無低平者即可入選。選出40只，隨機(jī)分為4組，每組10只。正常組及模型組予0.9%氯化鈉注射液灌胃；椰子殼揮發(fā)油組予椰子殼揮發(fā)油霧化給藥，生藥給藥量為5 g/(kg·d)；復(fù)方丹參滴丸組予80 mg/(kg·d)灌胃。各組均每日給藥1次，連續(xù)7 d，容積均為20 mL/kg。

1.2.2 急性心肌損傷模型的建立 從實(shí)驗(yàn)第6 d開始，正常組頸部皮下注射0.9%氯化鈉注射液，0.15 mL/只，其它各組大鼠頸部皮下注射鹽酸異丙腎上腺素注射液20 mg/(kg·d)，連續(xù)2 d，建立急性心肌損傷模型[2-3]。

1.2.3 取材 ①血清：給藥結(jié)束后，大鼠禁食水24 h，于實(shí)驗(yàn)的第8 d全部大鼠以10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后腹主動脈取血，于4 ℃，1 000 r/min，離心10 min，分離出血清，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩＂谛呐K：采血后迅速開胸取出心臟，除去大血管和結(jié)締組織，用濾紙吸干表面血液，迅速剪成10小塊并稱質(zhì)量、標(biāo)記，放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＂坌募驖{制備：稱取心肌組織200 mg，在4 ℃預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液中漂洗3次，濾紙吸干，用眼科剪迅速剪碎組織塊，按質(zhì)量體積比1∶9加入0.86%冷氯化鈉注射液1.8 mL，充分研磨，制備成10%心肌組織勻漿，按3 500 r/min，離心10 min，取上清液迅速冷凍保存待測，全程在冰上進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo) 分別檢測血清和心肌組織中下列心肌損傷標(biāo)志物的含量：AST(比色法)、α-HBDH(比色法)、CK(微板法)、CK-MB(比色法)、LDH(微板法)、LDH1(抑制法)、cTnT(血清：膠乳增強(qiáng)免疫比濁法；組織：放射免疫法)、cTnI(血清：膠乳增強(qiáng)免疫比濁法；組織：放射免疫法)、Mb(血清：膠乳增強(qiáng)免疫比濁法；組織：分光光度法)，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中各心肌損傷生物化學(xué)標(biāo)志物比較 見表1、2。

組 別nASTCKCK-MBLDHLDH1正常組101562．1±117．6262．6±44．2362．3±97．6163．4±34．4993．9±89．5模型組101931．2±246．9??636．5±99．4??631．2±83．3??356．9±28．0??1732．9±127．5??復(fù)方丹參滴丸組101660．2±200．7△272．7±53．0△472．6±42．1??△275．9±44．4??△1178．0±104．8?△椰子殼揮發(fā)油組101897．6±167．3??#263．9±23．1△458．8±71．1??△298．4±52．4??△#1145．7±130．6?△

與正常組比較，*Plt;0.05,**Plt;0.01；與模型組比較，△Plt;0.01；與復(fù)方丹參滴丸組比較，#Plt;0.01

組 別nα-HBDH(U/L)cTnT(ng/L)cTnI(ng/L)Mb(ng/mL)正常組10162．1±27．6138．6±47．298．7±17．6108．4±24．4模型組10291．2±46．9??381．5±69．3??431．2±53．3??181．9±38．9??復(fù)方丹參滴丸組10180．2±20．7?△172．7±53．1△272．7±42．1??△122．7±34．4△椰子殼揮發(fā)油組10175．6±27．3?△168．9±38．3△298．9±30．5??△118．9±26．1△

與正常組比較，*Plt;0.05,**Plt;0.01；與模型組比較,△Plt;0.01

由表1、2可見，與正常組比較，模型組AST、CK、CK-MB、LDH、LDH1、α-HBDH、cTnT、cTnI、Mb升高(Plt;0.01)，復(fù)方丹參滴丸組CK-MB、LDH、LDH1、α-HBDH、cTnI升高(Plt;0.01，Plt;0.05)，椰子殼揮發(fā)油組AST、CK-MB、LDH、LDH1、α-HBDH、cTnI升高(Plt;0.01，Plt;0.05)。與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸組AST、CK、CK-MB、LDH、LDH1、α-HBDH、cTnT、cTnI、Mb降低(Plt;0.01)，椰子殼揮發(fā)油組CK、CK-MB、LDH、LDH1、α-HBDH、cTnT、cTnI、Mb降低(Plt;0.01)。與復(fù)方丹參滴丸組比較，椰子殼揮發(fā)油組AST、LDH升高(Plt;0.01)。

2.2 各組大鼠心肌組織中各心肌損傷生物化學(xué)標(biāo)志物比較 見表3、4。

組 別nAST(U/gprot)CK(U/mgprot)CK-MB(U/mgprot)LDH(U/gprot)正常組10258．2±37．61728．7±184．21952．1±297．6260．1±25．2模型組10363．6±46．5??2006．2±325．4??2681．2±383．9??358．7±48．9??復(fù)方丹參滴丸組10295．9±60．1??△1782．7±203．0△2122．5±342．4??△272．7±54．7△椰子殼揮發(fā)油組10287．4±37．8??△1833．4±279．3?△2058．4±471．1??△268．9±48．4△

與正常組比較，*Plt;0.05,**Plt;0.01；與模型組比較，△Plt;0.01

組 別nα-HBDH(U/gprot)cTnT(pg/mL)cTnI(pg/mL)Mb(nmol/g)正常組10155．4±29．6248．6±27．2195．6±46．6502．7±64．2模型組10282．2±46．3??483．5±50．8??328．2±65．9??771．5±78．4??復(fù)方丹參滴丸組10180．2±40．4??△272．7±43．6△203．7±49．2△562．3±59．7△椰子殼揮發(fā)油組10186．6±37．8??△263．1±38．5△208．3±37．5△506．1±70．9△#

與正常組比較，**Plt;0.01；與模型組比較，△Plt;0.01；與復(fù)方丹參滴丸組比較,#Plt;0.01

由表3、4可見，與正常組比較，模型組AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH、cTnT、cTnI、Mb升高(Plt;0.01)，復(fù)方丹參滴丸組AST、CK-MB、α-HBDH升高(Plt;0.01)，椰子殼揮發(fā)油組AST、CK、CK-MB、α-HBDH升高(Plt;0.01，Plt;0.05)。與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸組、椰子殼揮發(fā)油組AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH、cTnT、cTnI、Mb均降低(Plt;0.01)。與復(fù)方丹參滴丸組比較，椰子殼揮發(fā)油組Mb降低(Plt;0.01)。

3 討 論

心肌損傷主要是由病毒、細(xì)菌、肺炎支原體等引發(fā)的各種感染、缺氧、缺血、免疫反應(yīng)、藥物心臟毒性、中毒、心臟手術(shù)等所致。異丙腎上腺素造成的心肌損傷有著多種病理生理機(jī)制的共同參與[4]，主要是通過對β1和β2受體的調(diào)制[5]，收縮心臟及外周血管，使冠狀動脈充盈不足，增加心肌耗氧量，致使心肌供血不足，造成心肌損傷[6]。

心肌損傷后，心肌細(xì)胞內(nèi)的各種成分包括多種酶類、蛋白質(zhì)及其他大分子被釋放入血[7]，其中某些成分能較為特異和敏感地反映心肌損傷，稱為心肌損傷生物化學(xué)標(biāo)志物。心肌損傷標(biāo)志物大致分2類，一類為酶類標(biāo)志物(主要包括LDH及同工酶、CK及同工酶、AST等)；一類為蛋白類標(biāo)志物(主要包括心肌肌鈣蛋白、Mb)[8]。隨著心肌標(biāo)志物研究和臨床應(yīng)用的深入，普遍認(rèn)為心肌損傷標(biāo)志物的檢測結(jié)果與病情進(jìn)展具有一致性。2004年美國臨床生化科學(xué)院起草的新的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)實(shí)踐指南(草案)中，建議所有由急性心肌缺血引起的臨床癥狀的患者都應(yīng)進(jìn)行心肌壞死標(biāo)志物測定[9]。因此，在臨床上判斷患者是否存在心肌損傷，除結(jié)合心電圖改變、臨床表現(xiàn)外，檢測心肌損傷標(biāo)志物是一種常用的重要診斷依據(jù)[10]。

我們通過注射大劑量鹽酸異丙腎上腺素制備大鼠急性心肌損傷模型，分別對大鼠血清和心肌組織中心肌損傷標(biāo)記物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：造模后，模型組大鼠血清和心肌組織中心肌損傷標(biāo)志物均明顯升高；椰子殼揮發(fā)油組大鼠血清中CK、CK-MB、LDH、LDH1、α-HBDH、cTnT、cTnI、Mb較模型組降低(Plt;0.01)；椰子殼揮發(fā)油組大鼠心肌組織中各生化標(biāo)志物較模型組均降低(Plt;0.01)；椰子殼揮發(fā)油組與復(fù)方丹參滴丸組比較，血清中AST、LDH和心肌組織中Mb差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為利用水蒸汽蒸餾法從椰子殼中提取的揮發(fā)油，可以降低急性心肌損傷大鼠血清和心肌組織中生化標(biāo)志物的活性，具有較好的改善心肌損傷的作用，其作用的機(jī)制為保護(hù)心肌細(xì)胞膜的完整性，減少心肌細(xì)胞內(nèi)酶類、蛋白質(zhì)及其他大分子釋放入血，減輕心肌細(xì)胞的損傷。

有研究表明，從艾葉[11]、薄荷[12]等中藥提取的揮發(fā)油具有通經(jīng)達(dá)絡(luò)、行氣散瘀、芳香開竅等作用[13]，那么椰子殼提取的揮發(fā)油是否同樣具有辛散通絡(luò)、行氣的功效，通過擴(kuò)張血管，增加供氧，減輕因缺血缺氧造成的心肌過氧化損傷，我們在后續(xù)的研究中將繼續(xù)探討。

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2017-06-24)

(本文編輯：李珊珊)

Effectsandanalysisofcoconutshellvolatileoilonbiochemicalmarkersinmyocardialinjuryrats

GAOXiujuan*,ZHANGGuangzeng,YAORongmei,etal.

*ExperimentCenterinCollegeofTraditionalChineseMedicine,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Hebei,Tangshan063210

ObjectiveTo observe the effects of coconut shell volatile oil on the biochemical markers of acute myocardial injury rats.Methods40 Wistar rats with limb Ⅱ lead electrocardiogram normal were randomly divided into 4 groups, namely, normal group, model group, coconut shell volatile oil group and compound Danshen dropping pill group, 10 rats in each group and continuous drug administration for 7 d. From the 6thd to the 7thd of the experiment, except for the normal group, the other rats were injected subcutaneously with isoprenaline hydrochloride into the neck to establish acute myocardial injury model. The contents of aspartate aminotransferase(AST),alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase (α-HBDH), serum creatine kinase (CK), creative kinase isoenzyme (CK-MB), lactate dehydrogenase(LDH), lactate dehydrogenase isoenzyme(LDH1), cardiac troponin T (cTnT), cardiac troponin I (cTnI) and myoglobin (Mb) were detected in the serum and myocardial tissue of the rats at the 8th day.ResultsCompared with the normal group, the AST, CK, CK-MB, LDH, LDH1, α-HBDH, cTnT, cTnI and Mb in the serum were increased in the model group (Plt;0.01), the CK-MB, LDH, LDH1, α-HBDH, and cTnI in the serum were increased in the Danshen dropping pill group (Plt;0.01,Plt;0.05), the AST, CK-MB, LDH, LDH1, α-HBDH and cTnI in the serum were increased in the coconut shell volatile oil group (Plt;0.01,Plt;0.05). Compared with model group, the AST, CK, CK-MB, LDH, LDH1, α-HBDH, cTnT, cTnI and Mb in the serum were reduced in the Danshen dropping pill group (Plt;0.01), the CK, CK-MB, LDH, LDH1, α-HBDH, cTnT, cTnI and Mb in the serum were reduced in the coconut shell volatile oil group (Plt;0.01). Compared with Danshen dropping pill group, the AST and LDH were increased in the coconut shell volatile oil group (Plt;0.01). Compared with the normal group, the AST, CK, CK-MB, LDH, α-HBDH, cTnT, cTnI and Mb in the myocardial tissue were increased in the model group (Plt;0.01), the AST, CK-MB, and α-HBDH in the myocardial tissue were increased in the Danshen dropping pill group (Plt;0.01), the AST, CK, CK-MB, and α-HBDH in the myocardial tissue were increased in the coconut shell volatile oil group (Plt;0.01,Plt;0.05). Compared with model group, the AST, CK, CK-MB, LDH, α-HBDH, cTnT, cTnI and Mb in the myocardial tissue were reduced in the Danshen dropping pill group and the coconut shell volatile oil group (Plt;0.01). Compared with Danshen dropping pill group, the Mb in the in the myocardial tissue were reduced in the coconut shell volatile oil group (Plt;0.01).ConclusionThe coconut shell volatile oil can reduce the release of a variety of enzymes, protein markers when myocardial injury, and to a certain extent inhibit the occurrence of myocardial injury.

Coconut; Myocardial disease; Wistar rats; Biochemical markers; Pharmacology of traditional Chinese medicine

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.10.028

※ 項(xiàng)目來源：“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)“十一五”計(jì)劃第二批課題(編號：2009ZX09103-442)；河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號：13272509)

△ 通訊作者：華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 唐山 063210

1 河北省唐山市協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，河北 唐山 063004

2 華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)教研室，河北 唐山 063210

高秀娟(1978—)，女，副教授，碩士。從事中醫(yī)學(xué)的教學(xué)與臨床工作。研究方向：心血管病的中醫(yī)藥防治。

R542.2；R285

A

1002-2619(2017)10-1550-05