烏司他丁聯合順鉑對胃癌細胞凋亡作用的研究

張 鑫，張 迪，饒艷偉，宋曉斌*

(1.吉林省人民醫院 急診外科,吉林 長春130021;2.長春理工大學醫院)

烏司他丁聯合順鉑對胃癌細胞凋亡作用的研究

張 鑫1，張 迪2，饒艷偉1，宋曉斌1*

(1.吉林省人民醫院 急診外科,吉林 長春130021;2.長春理工大學醫院)

胃癌是胃粘膜上皮的惡性腫瘤，其發病率和死亡率都位于第三位的惡性腫瘤。而且胃癌的發病年齡無局限性，胃癌的發病年齡常見于40-60歲[1]。現階段胃癌的治療方法主要是手術切除，之后化療輔助治療。順鉑為傳統化療藥物，其與DNA交聯誘導雙鏈斷裂而引起損傷，發揮其毒性作用，應用在胃癌化療的不同時段，如輔助化療的ECF方案，姑息化療的DCF方案和分子靶向治療的PF+曲妥珠單抗方案，在指南中都被作為Ⅰ類證據推薦臨床應用[2]。現有的研究發現順鉑化療有可能產生耐藥，降低了其治療功效。為了減少順鉑對化療癌癥的耐藥性，聯合其他藥物治療成為現階段研究的熱點。烏司他丁(UTI)為廣譜的蛋白酶抑制劑，可抑制多種水解酶活性(蛋白、脂類、糖類)，具有抗炎、減少細胞和組織損傷、改善微循環和組織灌注等作用。UTI被應用于治療急性胰腺炎、膿毒癥、ALI等，近年來在其抗腫瘤效應中也被很多研究者關注[3]。羅杰的研究證明了抑制乳腺癌細胞的上皮細胞-間質轉化，進而影響細胞的侵襲能力的下降[4]。所以，本研究設想聯合應用烏司他丁是否增加胃癌細胞系的凋亡作用，進而增加順鉑的化療效果。所以本研究以胃癌細胞BGC-823為研究對象，加入烏司他丁和順鉑處理細胞后，觀察細胞的生存率以及細胞凋亡相關蛋白的表達情況，探討聯合應用烏司他丁是否增加胃癌細胞系的凋亡作用。

1 材料與方法

1.1藥品及主要試劑順鉑(美國 Sigma 公司)，烏司他丁(天普生化醫藥股份有限公司公司)，Cleaved-caspase3蛋白抗體(美國 Abcam公司)，Cleaved-PARP蛋白抗體(美國 Abcam公司)。

1.2細胞培養人胃癌細胞BGC-823由吉林省人民醫院中心實驗室惠贈。BGC-823采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，置于37℃，5% CO2的恒溫二氧化碳細胞培養箱中培養，并保持一定的濕度。所有細胞均采用0.4%胰酶消化傳代培養。當細胞培養24 h后，正常組給予更換培養液；順鉑組給予更換含0.8 μg/ml順鉑培養液；烏司他丁組給予更換含400 U/ml的烏司他丁培養液；順鉑+烏司他丁組為加入0.8 μg/ml順鉑+400 U/ml烏司他丁作用。

1.3MTT法檢測胃癌細胞存活率按使用說明書用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)法檢測細胞生存能力。全自動酶標儀(波長590 nm)測定各孔OD值，計算細胞生存率。

1.4WesternBlot檢測胃癌細胞BGC-823中Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表達提取細胞總蛋白，Bio-Rad 法測定蛋白含量，然后按BCA蛋白定量試劑盒說明書步驟操作，測定樣品的蛋白濃度。用ImageJ圖像處理軟件計算各條豆類灰度值，分析Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白的表達情況。目的蛋白與內參照β-肌動蛋白(β-actin)的灰度值的比值進行描述表達情況。

2 結果

2.1MTT法檢測順鉑和烏司他丁處理過的胃癌細胞生存率

MTT結果顯示：與正常組相比，順鉑組、烏司他丁組、順鉑+烏司他丁組的細胞生存率明顯降低，有顯著的統計學意義(Plt;0.01)。與順鉑組和烏司他丁組相比，順鉑+烏司他丁組的細胞生存率明顯降低，有顯著的統計學意義(Plt;0.01)。見圖1。

2.2WesternBlot檢測胃癌細胞中Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表達

與正常組相比，順鉑組、烏司他丁組、順鉑+烏司他丁組的組中Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP表達明顯增加；與順鉑組和烏司他丁組相比，順鉑+烏司他丁組的凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP明顯降低，有顯著的統計學意義(Plt;0.01),如圖2。

圖1 經過順鉑和烏司他丁處理的胃癌細胞BGC-823細胞生存率

圖2 Western Blot檢測順鉑和烏司他丁處理的胃癌細胞Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表達

3 討論

我國的所有癌癥中，胃癌的發病率居首位，死亡率高。其治療方案主要以手術為主，之后予以化療輔助治療。在根治性手術的圍手術期，常通過化療延長生存周期。對于病理惡性程度高的胃癌根治術后的患者，瘤體面積大于5 cm的多發性癌灶和根治術后復發的患者通常給予化療治療。現在的化療藥物主要為順鉑、氟尿嘧啶、絲裂霉素、紫杉醇、阿霉、草酸鉑、拓撲酶抑制劑、希羅達等化療藥物。現有的研究發現順鉑化療有可能產生耐藥，降低了其治療功效[5]。為了減少順鉑對化療癌癥的耐藥性，聯合其他藥物治療成為現階段研究的熱點。本研究為了提高順鉑的化療藥物，擬聯合烏司他丁對胃癌細胞進行處理。本研究發現，單獨應用烏司他丁能降低胃癌細胞的生存率。同時還發現經過烏司他丁處理過的胃癌細胞中凋亡標志性相關蛋白Cleaved-Caspase3和Cleaved-PARP的表達水平明顯增加，這說明烏司他丁能增加胃癌的凋亡水平。而烏司他丁被認為是廣譜的蛋白酶體抑制劑，對胃癌細胞的作用可能通過對蛋白酶體的抑制作用，影響胃癌細胞中蛋白酶體的降解系統。王云花發現了烏司他丁能明顯抑制人結腸癌細胞lovo細胞的增殖和侵襲能力，以及增加了細胞中Caspase3的表達，增加了細胞的凋亡發生[6]。李燕在人絨毛膜癌細胞系中證實了烏司他丁通過抑制uPA的表達降低細胞的侵襲能力[7]。在程偉華的研究中發現了在胃癌組織中uPA表達增加[8]。所以，我們懷疑是不是烏司他丁通過影響細胞內的uPA的表達來改變細胞的凋亡水平，還需要我們的后續試驗進一步驗證。之后我們將烏司他丁與順鉑聯合處理胃癌細胞，發現與單獨應用順鉑組相比，聯合用藥組細胞生存率明顯降低，同時通過Western Blot我們還發現了胃癌細胞中Cleaved-Caspase3和Cleaved-PARP蛋白的表達水平明顯增加。這說明了聯合應用烏司他丁與順鉑能明顯增加胃癌細胞的凋亡水平，其具體作用機制還有待于進一步探討。在現階段的研究中認為胃癌組織中存在uPA表達增加，而uPA被認為和癌細胞的轉移有關系，同時我們還知道烏司他丁是一個廣譜的蛋白酶體抑制劑，在本研究中我們還不能確定烏司他丁是通過uPA的改變來影響細胞凋亡水平，還是通過其蛋白酶體抑制作用來增加順鉑對胃癌細胞的凋亡的作用，這需要進一步的試驗進行驗證。

總之，本研究證明了聯合應用順鉑和烏司他丁能增加人胃癌細胞的死亡率，增加細胞的凋亡的發生。順鉑和烏司他丁聯合用藥可能提高對抗腫瘤的敏感性，有可能為臨床的胃癌患者的化療提供一種新的治理策略，但是其具體作用途徑還需要進一步的試驗驗證。

[1]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69.

[2]Cunningham D,Allum WH,Stenning SP,et al.Perioperative chemotherapy versus surgery -lone for resectable gastroesophageal cancer[J].N Engl J Med,2006,355(1):11.

[3]Sun Z J,Yu T,Chen J S.et al.Effects of ulinastatin and cyclophosphamide on the growth of xenograft breast cancer and expression of CXC chemokine receptor4 and matrix metallproteinse-9 in cancers[J].J Int Med Res，2010，38(3):967.

[4]羅 杰.烏司他丁和泰索帝對人乳腺癌增值、侵襲及uPA、uPAR、ERK表達的影響[D].重慶醫科大學碩士論文，2010.

[5]Kelland L.The resurgence of platinum-based cancer chemotherapy[J].Nat Rev Cancer，2007,7(8):573.

[6]王云花.烏司他丁對人結腸癌lovo細胞增值，侵襲，凋亡及HMGB1的影響[D].南方醫科大學2011級碩士畢業論文.

[7]李 燕.烏司他丁對人絨毛膜癌uPA表達及侵襲的影響[D].中南大學碩士畢業論文，2010.

[8]程偉華.p-p38和uPA在胃癌組織中的表達及其意義[D].南昌大學醫學院碩士畢業論文，2010.

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1973-02

張鑫，男，主治醫師，碩士研究生，主要從事胃癌的外科治療方面研究。

2016-07-13)