烏司他丁干預水下爆炸致兔急性肺損傷NF-κB、MMP-9的表達變化

李雪萍，齊曉林*，葉長青，王前進，邵先安*，馬宏昊

(1.蚌埠醫學院附屬解放軍第123醫院 檢驗科，安徽 蚌埠233015； 2.中國科技大學 近代力學系爆炸實驗室，安徽 合肥230027)

烏司他丁干預水下爆炸致兔急性肺損傷NF-κB、MMP-9的表達變化

李雪萍1，齊曉林1*，葉長青1，王前進1，邵先安1*，馬宏昊2

(1.蚌埠醫學院附屬解放軍第123醫院 檢驗科，安徽 蚌埠233015； 2.中國科技大學 近代力學系爆炸實驗室，安徽 合肥230027)

目的探討烏司他丁干預對水下爆炸致兔急性肺損傷血清核轉錄因子(Nuclear factor kappa B,NF-κB)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)的表達影響。方法以水下爆炸裝置復制兔急性肺損傷模型，檢測爆炸后4、12和24 h血清NF-κB、MMP-9變化。結果爆炸后4 h烏司他丁組NF-κB的表達(818.60±222.48 ng/L)和損傷組(1052.40±243.87 ng/L)相比降低(t=2.240,P=0.038)；爆炸后12 h烏司他丁組(730.10±153.34 ng/L)和損傷組(1000.90±407.87 ng/L)相比未見顯著變化(t=1.965,P=0.065)；但在爆炸后24 h烏司他丁組(656.70±214.02 ng/L)和損傷組(1035.30±362.00 ng/L)相比表達量又顯著降低(t=2.847,P=0.011)。MMP-9在爆炸后4 h、12 h烏司他丁組損傷組未見顯著差異；但爆炸后24 h烏司他丁組(28.40±8.30 μg/L)血清MMP-9表達顯著低于損傷組(42.10±15.24 μg/L)(t=2.497,P=0.022)。結論烏司他丁干預下實驗兔在爆炸后24 h血清NF-κB、MMP-9明顯降低。

烏司他丁；水下爆炸；急性肺損傷；NF-κB；MMP-9

(ChinJLabDiagn,2017,21:2000)

一般認為，空氣中爆炸致實驗動物胸部、腹部或脊髓等損傷較多[1]，而水下沖擊傷是島礁作戰和渡海登陸作戰中常見的一種損傷，尤其以肺部損傷最為嚴重,是傷者死亡的主要原因之一[2]。目前對水下爆炸沖擊波致實驗動物肺損傷及救治的研究甚少。有文獻提示空氣爆炸傷引起的急性肺損傷(acute lung injury,ALI) 是由多種炎性遞質及效應細胞共同參與，并呈級聯放大的瀑布樣炎癥與繼發性彌漫性肺實質損傷。在參與炎癥反應與肺損傷中的眾多炎癥遞質中， NF-κB是與創傷相關的核轉錄因子之一，是多種信號轉導途徑的匯聚點[3]。該因子參與巨噬細胞和白細胞活化，控制著許多促炎因子的表達[4]，在嚴重創傷所致多器官功能損害的發生發展中起關鍵性的作用[5]。基質金屬蛋白酶9(matrix metal proteinases-9,MMP-9)是金屬蛋白酶家族中最重要的一類，在肺損傷過程中具有增強炎癥因子效應，加大肺組織損傷[6]的作用。烏司他丁是從人尿液中分離純化的一種廣譜胰蛋白酶抑制劑，可抑制炎癥因子的釋放，阻止急性肺損傷的發生發展，有效緩解急性炎癥引起的肺損害[7]。因此，我們對急性肺損傷兔給予烏司他丁治療，通過監測血清NF-κB 和MMP-9變化探討烏司他丁在水下爆炸致兔急性肺損傷時對NF-κB 和MMP-9表達的影響，從而為肺損傷的致病機制和臨床救治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1儀器和試劑DNM-9602 酶標分析儀(北京普朗)；烏司他丁( 廣東天普生化醫藥股份有限公司，批號031505264)；兔MMP-9 ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，批號201602)；兔NF-κB ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，批號201602)

1.2實驗動物及方法健康成年新西蘭兔20只(安徽長臨河醫藥科技有限公司，許可證號syxk(皖)2007-002)，體重1.8±0.2 kg。動物實驗前適應性喂養3天，自由飲食飲水，觀察一般情況及生命體征無異常即可用于實驗。將動物隨機分為爆炸損傷組(10只)和烏司他丁治療組(用量2.5萬單位/kg體重，10只)。實驗前動物禁食6 h，按照氯胺酮40 mg/kg,氟哌利多1.6 mg/kg肌肉注射，麻醉時間3-5 min[8-9]。麻醉后，仰臥位固定在動物臺上，頸前部和胸部去毛，盡量完全暴露胸部，分別經左頸總動脈和右頸外靜脈向心方向放置留置針，并將留置針的體外部分繞頸固定，以防脫落。爆炸試驗前將動物上肢再固定，防止滑落，按有關文獻和預試驗結果設定爆炸劑量、距離[10]。爆炸后立即解綁家兔，注意保暖，清理呼吸道，使其右側臥位，立即記錄呼吸、精神狀態、應激反應等情況。烏司他丁治療組實驗兔在爆炸后即刻通過靜脈置管給予藥物，爆炸損傷組實驗兔給予同等劑量生理鹽水。在爆炸后4 h、12 h、24 h分別用5 ml注射器經頸總動脈置管抽取5 ml的動脈血，緩慢注入紅色干管內并進行標記。由于兔的血液呈高凝狀態，為防止血栓形成，每次抽取動脈血樣后及時給予肝素封管[11]。將分離好的血清放入-40℃冰箱內凍存備用。采用ELISA方法檢測MMP-9、NF-κB含量，實驗嚴格按照說明書進行。

1.3統計學分析數據采用SPSS17.0 統計軟件處理，Plt;0.05視為有統計學意義。

2 結果

為探討炎性因子NF-κB和MMP-9在爆炸性肺損傷中的可能作用，我們采用ELISA 方法對損傷組和烏司他丁組兔血清細胞因子濃度進行了檢測，結果顯示烏司他丁組與損傷組相比血清NF-κB濃度在爆炸后4 h(t=2.240,P=0.038)、24 h均(t=2.847,P=0.011)明顯降低，而12 h(t=1.965,P=0.065)則未見顯著改變(表1)。血清MMP-9在爆炸后4、12 h未見顯著改變，但24 h時烏司他丁治療組血清MMP-9則降低(t=2.497,P=0.022)(表1)，提示烏司他丁干預治療后炎性因子NF-κB和MMP-9的降低可能有利于機體發揮保護作用，減少炎癥損傷，在爆炸性肺損傷中扮演著重要作用。

表1 各組在不同時間點血NF-κB(ng/L)和MMP-9(μg/L)濃度的比較

3 討論

水下爆炸傷要比空氣爆炸傷死亡率高得多，而肺是體內比較脆弱、柔軟且含氣的組織,最易受到沖擊，是主要的受損靶器官[12]。在肺損傷的過程中，多種炎癥因子參與其中，在治療上，有效控制肺部過度炎癥反應是治療ALI的關鍵[13]。烏司他丁能夠抑制氧自由基產生，抑制白細胞過度激活、保護血管內皮和基膜、抑制血管通透性增加，是常用的急性炎癥反應治療藥物[14]。我們通過復制水下爆炸致兔急性肺損傷，并在爆炸即刻給予烏司他丁治療。結果顯示烏司他丁干預24 h內NF-κB和MMP-9濃度顯著下降，表明烏司他丁在急性炎癥早期使用能夠明顯抑制NF-κB和MMP-9的釋放。NF-κB是與創傷相關的核轉錄因子之一，在創傷后的急性炎癥反應過程中具有多種功能[3-5]。我們的實驗結果提示在炎癥發生時就使用烏司他丁可能會減少血清NF-κB和MMP-9的釋放，有助于創傷性炎癥的好轉，與有關研究相類似[15]。在肺損傷過程中MMP-9 是參與降解破壞細胞外基質中的最主要組成成分，且能增強放大炎癥因子效應，使中性粒細胞在肺局部浸潤，刺激肺組織局部的實質細胞釋放出更多的MMPs。另外，MMP-9還可以刺激肺組織局部的實質細胞如肺成纖維細胞、肺泡Ⅱ型上皮細胞和血管內皮細胞等釋放出更多的MMPs，放大對肺組織的損傷[6]。有學者通過降低MMP-9含量改善心肌纖維化程度[16]，而我們實驗中早期應用烏司他丁治療降低了MMP-9的表達，可能有助于肺損傷的治療。

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InvestigationofNF-κBandMMP-9inseraofrabbitswithacutelunginjuryinterposedbyUlinastatininunderwaterexplosion

LIXue-ping1,QIXiao-lin1*,YEChang-qing1,etal.

(1.TheDepartmentofClinicalLaboratoryoftheAffiliated123rdHospitalofPLAofBengbuMedicalCollege,Bengbu233015,China;2.LabofExplosionMechanicsofDepartmentofModernMechanicsintheUniversityofScienceandTechnologyofChina,Hefei230027,China)

ObjectiveThe aim of this research was to elucidate the change of NF-κB and MMP-9 in the rabbits with acute lung injury interposed by Ulinastatin enduring underwater explosion.MethodsUnderwater explosion decive was applied to cause acute lung injury in rabbits.The NF-κB and MMP-9 concentration was detected by ELISA methods at 0,4,12 and 24 hour after explosion,respectively.ResultsThe expression of NF-κB in sera of rabbits in ulinastain group (818.60±222.48 ng/L) were significant lower than that of in injury group (1052.40±243.87 ng/L) (t=2.240,P=0.038) at 4 hours after burst.Meanwhile,at 12 hours after burst,there were no significant difference between ulinastain group (730.10±153.34 ng/L) and the injury group(1000.90±407.87 ng/L)(t=1.965,P=0.065).Nevertheless,the expression of NF-κB in the sera of rabbits in ulinastatin group (656.70±214.02 ng/L ) were lower than that of in injury group(1035.30±362.00 ng/L)(t=2.847,P=0.011) at 24 hour after burst.On the other hand,there was no significant difference in the expression of MMP-9 in sera of rabbits between the ulinastain and injury group at 4 hours and 12 hours after burst.Nevertheless,the MMP-9 concentration in rabbits sera in the ulinastatin group (28.40±8.30 μg/L) were lower than that of in injury group (42.10±15.24 μg/L)(t=2.497,P=0.022).ConclusionThe NF-κB and MMP-9 expression in sera of the rabbits in ulinastatin group were dramatically decreased than that of in injury group at 24 hours after burst.

Ulinastatin;underwater explosion;acute lung injury;NF-κB;MMP-9

南京軍區醫學重點課題資助項目(14ZD20)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-2000-03

R561

A

李雪萍(1991-)，女，在讀研究生，主要從事分子免疫研究。

2016-11-17)