腸癌組織中抗生素檢測及胃腸消化模擬

劉一楠,王佳麗,張同森,陳 雷,沙 爽,張玉玲,邰建東*

(1.吉林大學第一醫院 結直腸肛門外科，吉林 長春130012；2.吉林大學環境與資源學院)

腸癌組織中抗生素檢測及胃腸消化模擬

劉一楠1,王佳麗2,張同森1,陳 雷1,沙 爽1,張玉玲2,邰建東1*

(1.吉林大學第一醫院 結直腸肛門外科，吉林 長春130012；2.吉林大學環境與資源學院)

環境中普遍存在的藥物殘留物，已經成為潛在的環境生態危險源。磺胺類藥物是常用的一組人工合成的、具有對氨基苯磺酰胺結構的一類藥物總稱，具有較強的抑菌性，被廣泛應用于家畜細菌傳染病的預防和治療,同時也用來作為生長劑促進動物生長[1]。動物在使用磺胺類藥物以后，部分藥物將以原型化合物或代謝產物的形式隨排泄物進入生態環境，給土壤、水體等帶來不良影響，影響人類健康，其不良后果不容忽視[2]。由于在畜禽養殖及臨床醫療上抗生素的大量使用并不斷向環境中排放，造成水資源和土壤環境的嚴重污染，并誘發許多細菌產生耐藥性，對人類健康造成威脅[3]。

體外胃腸模擬法為研究學者研究人類及動物提供了一種簡單、快速、低成本的方法，該方法廣泛應于各類物質的研究[4,5]。該方法曾用于測試多酚、黃酮類及咖啡黑色素抗氧化性能等[6,7]。目前國內外對于磺胺類抗生素已有部分研究，主要集中于磺胺類抗生素的檢測方法[8]、水土中的遷移轉化[9]、抗性基因[10]、污染修復[11,12]等方面的研究，但對于磺胺類抗生素的胃腸消化模擬實驗還未見，而已有報道在兒童尿液中檢測出磺胺類抗生素，該胃腸模擬研究可為抗生素在人體內的消化代謝規律及腸癌致病風險提供依據[13]。

1 資料與方法

1.1主要儀器

超聲清洗儀、恒溫水浴鍋、Agilent_1200高效液相裝置(Agilent公司，美國)、WFZ UV-2100型紫外可見分光光度計(上海博迅儀器有限公司)、電子天平(AL104，METTLER TOLEDO儀器有限公司)。

1.2主要材料

收集我院結直腸肛門外科大腸癌手術標本共34例，其中男20例，女14例，年齡范圍45-79歲，平均年齡65.2歲，體重59-75 kg，平均體重65 kg。并于距腫瘤大于5.0 cm處取材近端腸管正常組織34例作為對照組。

1.3藥品與試劑

正己烷、乙腈(色譜純)；乙酸、無水硫酸鈉(分析純)、ST 、SM、SM2、SMX，磺胺藥物購自SIGMA 公司，純度均大于99.99%；甲醇(色譜純)，甲酸，胃蛋白酶(EP232-25G)、胰蛋白酶(ET355-25G)等，實驗用水為超純水。

1.4腸部組織樣本分析實驗

方法：稱取預處理樣品5 g置于離心管中，加入無水硫酸鈉20 g，乙酸-乙腈(1+99)混合溶劑20 ml，超聲提取 30 min，殘渣中加入乙酸-乙腈(1+99)混合溶劑20 ml，超聲提取10 min，上清液一并轉入棕色瓶中，40℃水浴中加熱破乳去上層油脂，加入正己烷凈化，氮吹濃縮[14,15]，取下清液過0.22 μm濾膜，高效液相儀測試分析[16]。

1.5抗生素胃腸消化實驗(表1)

1.5.1胃消化模擬實驗方法 磺胺類抗生素實驗設置一個人體模擬組(完全模擬人體環境)，三個對照組，各組除胃液、腸液成分加入不同外，其余條件均相同。取500 ml棕色瓶(錫箔紙包裹)，加入胃液50 ml，及抗生素，磺胺類抗生素初始濃度為0.25 mg/mL，通N2(避免空氣氧化)，于37℃水浴中搖動。在消化時間為0.5、1、1.5、2 h時取上層清液經0.22 μm濾膜過濾后用HPLC測定。磺胺類抗生素實驗設置一個樣品組，三個對照組，對照組1胃模擬部分與樣品組相同，對照組2用蒸餾水代替胃液，對照組3用蒸餾水代替胃液中的HCl(區分酸環境與胃蛋白酶的作用)[17,18]。

1.5.2腸消化模擬實驗方法 胃模擬實驗后，在樣品組中加入40 ml的腸液，并用1 mol/L的NaHCO3調節各溶液pH至7.5，對照組1中加入等量0.1 mol/L的NaHCO3代替腸液(區分堿性環境和胰蛋白酶的作用)，對照組2中加入40 ml的腸液并用1 mol/L的NaHCO3調節溶液pH至7.5(只有腸液作用)。在消化時間為0.5、1、2、3、4 h時取上層清液經0.22 μm濾膜過濾后用HPLC測定[19,20]。

表1 各組加入胃液、腸液內物質情況

2 結果

2.1腸部組織樣本測試結果分析

通過對34名病患樣本進行測試分析(圖1-4)，少量病患體內組織含有磺胺類抗生素，磺胺類抗生素在正常組織部位和病患組織部位均有富集，4種抗生素測試出峰時間分別為2.344s、2.967s、3.907s、5.388s。受地域限制，本次病患樣本多來自東北地區，東北區某受污染的地下水土中曾有磺胺類抗生素的檢出，受污染的水土可能通過各種途徑進入人體，而影響人體健康[21]，其中SM2最高檢出含量達8.03 μg/kg。

圖1病患樣本ST含量圖2病患樣本SM含量

圖3病患樣本SM2含量圖4病患樣本SMX含量

2.2胃腸消化模擬實驗結果分析

2.2.1磺胺類抗生素的胃腸消化規律 人體模擬組(圖5)模擬了整體胃腸消化過程。在胃消化階段，4種抗生素均在1.5h時達到最大消化率，SMX的消化率較高為80%，SM和ST的胃消化過程相似，最高達到30%，而SM2消化率僅為8%；胃消化主要在后1 h內進行。在腸模擬消化階段，SMX的消化率下降至5%，再最后的2 h回升至15%，SM2的消化率為20%，而ST和SM腸消化初期消化率均達到50%以上，在腸消化后期有所下降。可見SMX的消化主要在胃消化階段進行，而ST、SM、SM2的消化主要在腸消化階段進行。

對照組1(圖6)在胃消化階段與樣品組相同，而在腸消化階段加入0.1 mol/L的NaHCO3代替腸液，在胃消化階段與樣品組相似，SMX的消化率最高；而在腸消化階段沒有胰蛋白酶的作用時，四種磺胺類抗生素的消化規律相似，最高消化率在50%左右，而在腸消化后期有所下降，可見胰蛋白酶對4種磺胺類抗生素有一定的作用，且作用程度不同，對SM2及SMX的消化有一定的抑制作用，而對SM的消化有促進作用，對ST幾乎沒有影響。

圖5人體模擬組4種抗生素消化率圖6對照組14種抗生素消化率

對照組2(圖7)在胃模擬加入超純水代替胃液，4種磺胺類抗生素含量有較大波動，但在胃模擬結束時，四種磺胺類抗衡素的殘留量接近初始值，進入到腸模擬階段，四種抗生素消化規律相似，消化率均在3h時達到最大，沒有經過胃液消化的抗生素，在加入腸液后消化率均僅在5%以下，可見在4種磺胺類抗生素的消化過程中胃消化起著很大的作用。

對照組3(圖8)只模擬了胃消化階段，且加入不含HCl的胃液，與樣品組對比，在僅有胃蛋白酶作用下，各抗生素的消化率均增高，ST和SM在55%左右，SMX消化率最高在80%左右，而SM2最低為30%左右。可見酸性環境不利于磺胺類抗生素的消化。

圖7對照組24種抗生素消化率圖8對照組34種抗生素消化率

2.2.2胃腸消化酶作用規律分析 實驗設置實驗組和對照組[22]，對照組不添加磺胺類抗生素，如圖9、10實驗組和對照組的胃蛋白酶活性變化趨勢相近，實驗組酶活性在0.06 μg/g左右，酶活性總體上大于對照組。在胃模擬0.5和1.5 h時磺胺類抗生素的消化率上升時，胃蛋白酶活性也上升，可見胃蛋白酶可以提高磺胺類抗生素的消化率。

胰蛋白酶測試同樣實驗設置實驗組和對照組，對照組不添加磺胺類抗生素，對照組的胰蛋白酶活性在70上下波動，而實驗組的胰蛋白酶性變化較大，其變化趨勢與磺胺類抗生素消化率的變化趨勢相近，可見磺胺類抗生素也促使了胰蛋白酶活性的增長。

3 討論

3.1在34名腸癌患者中，共有23名患者檢出磺胺類抗生素，其中有8名檢出有兩種磺胺類抗生素。可見磺胺類抗生素可以通過一些途經由水土環境中進入到人類體內，并存留，可能會對人體健康造成威脅。

圖9胃蛋白酶活性變化圖10胰蛋白酶活性變化

3.2抗生素的胃腸消化模擬實驗中，SMX在胃消化1.5 h時消化率最大為80%；在各對照實驗中，胰蛋白酶對SM2及SMX的消化有一定的抑制作用，而對SM的消化有促進作用，對ST幾乎沒有影響；沒有經過胃液消化的抗生素，在進入腸消化時消化率均僅在5%以下，可見在四種磺胺類抗生素的消化過程中胃消化起著很大的作用；在僅有胃蛋白酶作用下，各抗生素的消化率均增高。

3.3通過對酶活的測定，胃蛋白酶活性及胰蛋白酶活性與磺胺類抗生素的消化率呈正相關。

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本項目受吉林省財政廳應用類科研基金資助(2016swszx017)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1948-05

劉一楠(1987-)，男，碩士研究生，從事結直腸肛門疾病的研究;邰建東(1972-)，男，博士，副教授，從事結直腸肛門疾病的研究。

2017-02-14)