多腫瘤標記物檢測試劑盒的方法學評估

趙 虹，田振華，趙曉紅

(吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033)

多腫瘤標記物檢測試劑盒的方法學評估

趙 虹，田振華*，趙曉紅

(吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033)

腫瘤標記物(Tumor marker,TM)是存在于腫瘤組織和細胞的特異性物質，其性質與正常組織和細胞所表達的物質和抗原有區別，在正常組織或良性疾病不產生或產生甚微，主要是在腫瘤細胞內產生并分泌到體液中的物質[1]。常用血清作為樣品。腫瘤標記物的發現，為腫瘤的早期診斷、反映病程、指導治療、評估療效、監測復發或轉移以及提示預后等方面，提供了有價值的參考指標。

現已發現的腫瘤標記物有：腫瘤特異性及相關抗原、激素、受體、酶和同工酶、癌基因及其產物等數十種。(1)蛋白質類：AFP(肝細胞癌和生殖細胞腫瘤)、CEA(廣譜腫瘤)；(2)糖類抗原：CA125(卵巢癌)、CA15-3(乳腺癌)、CA19-9(胰腺癌和結、直腸癌)、CA24-2(胰腺癌、膽道癌)、Cyfra21-1(乳腺癌)、F-PSA；T-PSA(前列腺癌)和SCCA(鱗狀細胞癌)；(3)酶類：NSE(小細胞肺癌)；(4)激素類：free-β-HCG(婦科腫瘤和非精原性睪丸癌)。

腫瘤標志物不能作為腫瘤診斷的主要依據，只能用于腫瘤輔助診斷。因此腫瘤標志物的檢測要注意假陽性和假陰性的問題，為了提高腫瘤標志物的輔助診斷的價值和確定何種標志物可作為治療后的隨訪監測指標可進行腫瘤標志物的聯合檢測，合理正確地選擇幾種標記物聯合檢測是十分重要的[2,3]。

臨床上應用的多腫瘤標志物蛋白芯片檢測系統是基于雙抗體夾心法的化學發光檢測方法，在固相基質上包被 12 種腫瘤標志物的抗體，捕捉被檢者血清中對應的腫瘤標志物，結合第二抗體，然后催化化學反應產生光信號，用專門的芯片閱讀儀讀取光信號[4,5]。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

本實驗用的實驗儀器包括：自動平衡離心機(型號：DT5-2)；透景QiHand(嘉興凱實生物科技有限公司)；Luminex200多功能流式點陣儀(上海透景生命科技有限公司)；全自動流式熒光發光免疫分析儀(型號：TesmiF4000)；1 ml、200 μl、50 μl移液槍(sartorius)。

本實驗用的實驗試劑包括：多腫瘤標記物(7種)檢測試劑盒；糖類抗原15-3定量檢測試劑盒；多腫瘤標記物(4種)檢測試劑盒，以上試劑均在上海透景生命科技股份有限公司購買。

血清標本來自吉林大學中日聯誼醫院的臨床樣品100例，男性占56%，平均年齡62歲，女性占44%，平均年齡65歲，其中體檢39例，病房患者34例，門診27例。

1.2檢驗原理

本試劑盒使用Luminex200多功能流式點陣儀檢測血清中的男性12項，女性10項的腫瘤標記物。針對多腫瘤標記物抗原的捕獲抗體通過共價交聯在熒光編碼的微球上，并以一定數量制備成懸液即B液，與標準品或是血清樣本經37℃孵育5 min后，加入藻紅蛋白(PE)標記的針對抗原檢測抗體溶液即C液，37℃孵育1 h反應。這樣，在各熒光編碼的微球上就形成了與微球體交聯的抗體-腫瘤標記物抗原-檢測抗體PE的復合物。

在多功能流式點陣儀上，這些熒光編碼的微球被微量液體傳送系統排成單列，通過兩束激光，一束判定微球的編碼從而確定被測腫瘤標記物的種類，另外一束激發微球上的PE而發熒光。微球上PE的熒光強度與血清中的多腫瘤標記物的濃度正相關，標準品濃度分別對其熒光信號可擬合成劑量-反應標準曲線。從曲線方程即可計算出血清中的各種腫瘤標記物抗原濃度。

1.3檢驗方法

1.3.1準備工作：從4度冰箱中取出7項(AFP、CA125、CYFRA21-1、CA24-2、CEA、free-β-hCG、NSE)，4項(CA19-9、SCCA、F-PSA、T-PSA)和CA15-3定量檢測試劑盒置于室溫平衡30 min。加純凈水200 μl復溶7項和4項的標準品，混勻后備用，CA153標準品可直接使用。用移液槍吹打3個試劑盒的B液20次，吹打C液50次。

1.3.2加樣：在透景QiHand儀器的試劑架中第一排放7項的A液、B液和C液，第二排放4項的A、B、C液，第三排放CA15-3的A、B、C液。 在樣品架中，放入7項、4項、CA15-3的標準品和待測樣品。點擊運行開始加樣，儀器在96孔板上依次加入：反應緩沖液A25 μl/孔，血清樣本10 μl/孔(CA15-3要先將血清用稀釋E液稀釋20倍)，微球B液25 μl/孔，板子震蕩20 s，置于37度孵箱內避光反應5 min，加入PE標記二抗C液25 μl/孔，板子震蕩20 s，置于37度孵箱內避光反應1 h，反應結束后，加終止反應D液100 μl/孔。

1.3.3讀板：Luminex200多功能點陣儀在使用前需開機預熱30 min，點擊shut up清洗管路。讀板時先設置項目批號，開始讀板，檢測時間7項大約45 s/孔，4項大約40 s/孔，CA15-3大約35 s/孔。讀板結束后shut off清洗管路。

1.3.4測定結果計算：在Luminex200多功能流式點陣儀上可讀出的標準品及樣本熒光信號數值，輸入標準品濃度后用儀器內置配套軟件可自動計算出對應的血清樣本中多腫瘤標記物的濃度。

為保證吊運材料安全，需用鋼筋做1個籠子。籠子的底面制作為可拆裝式，便于裝卸材料。最大起吊質量200 kg，卷揚機選用3 t的，鋼絲繩選用左交互捻Ф 10(6×19)纖維芯，公稱抗拉強度1 570 MPa。

1.4方法學評估

對流式熒光發光法進行了準確度、批間和批內精密度、線性范圍、穩定性實驗和干擾試驗。

2 結果

2.1準確度

用衛生部質控標準品高、中、低三個批號的樣品進行檢測，比較實測濃度與參考值的大小，如表2。%偏倚=(檢測平均值-參考值)/參考值，檢測值均在允許的范圍內。

表2 準確度試驗結果表

2.2精密度

三種批號的試劑盒重復5孔持續測定同一個樣品，進行精密度分析。計算批內變異系數和3個批號試劑盒的批間變異系數，測得批內CV值小于10%，批間CV值小于15%。

2.3線性范圍

本試劑盒各項指標的線性范圍如表4，在線性范圍內，試劑盒的相關系數R2≥0.99。

2.4穩定性實驗

取試劑盒分別放置于37℃7天或者4℃一年，觀察各階段試劑的物理外觀，鑒定保存期間標準品活性變化，評價其線性范圍、準確度、精密度等指標。確定試劑盒有效期為12個月。

2.5干擾試驗

可以產生對血清學檢測干擾的常見原因有室內溫度，試劑污染，標本嚴重脂血和樣品溶血。

2.5.1溫度因素：溫度會使激光產生偏移，在22℃-26℃范圍內可以調節，溫度變化超過±7℃時，會影響結果的準確性，因此要保證操作溫度在一定的室溫下，不可以溫度過高或是過低。

2.5.2試劑污染如汗液、唾液、微生物等引起的污染：可能會引起SCCA的假陽性，如果檢測患者的SCCA結果均大于正常值，應考慮是不是試劑污染，需要重新換新試劑進行SCCA的測定，要注意在打開SCCA試劑盒后，用移液槍吹打試劑時應避免污染性操作。

表4 線性范圍

2.5.3標本嚴重脂血(血清呈現乳白色)：在運行時，會導致儀器管路堵塞，從而影響儀器的正常使用，遇到這種情況，血清應稀釋5倍后進行測量。

2.5.4樣品溶血：紅細胞膜破裂，膜上的NSE釋放會干擾血清中NSE的測定，會出現一些假陽性。

3 討論

臨床上用于檢測腫瘤標記物的定量檢測試劑盒有很多，本文基于流式熒光發光法，利用Lumine X200儀器檢測腫瘤標記物，對此方法進行方法學評估。

該方法準確度高，該方法的批間CV值小于15%，批內CV值小于10%，精密度符合國家標準；在線性范圍內，試劑盒的相關系數R2≥0.99，線性關系良好；試劑盒的穩定性好，可保存1年；該檢測方法需要保持室內溫度相對恒定；試劑污染會出現SCCA的假陽性；當標本嚴重脂血時，應稀釋進行測定；樣品溶血會出現NSE的假陽性，因此結果不能單獨作為各種腫瘤疾病或臨床良性疾病存在與否的判斷依據，必須與物理化學臨床診斷相結合后作出相應確診。該檢測方法仍存在一些局限性，有望進一步提升與改進。

[1]王孝平,宮樹林.腫瘤標記物的臨床應用[J].臨床檢驗,2006,3(11):136.

[2]潘繼文,李京南.腫瘤標記物聯合檢測的臨床應用[J].醫學理論與實踐,2005,18(2):125.

[3]于瑞珍,周善良.腫瘤標記物檢測的臨床應用價值[J].四川腫瘤防治,2001,14(4):252.

[4]李江,孫蜀勇.12種腫瘤標記物聯合檢測的臨床應用及評價[J].重慶醫科大學學報,2006,31(3):455.

[5]任志奇.基于磁珠固相載體的時間分辨熒光免疫分析技術平臺的建立及臨床應用[D].南京醫科大學,2016,5.

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1945-03

2017-01-15)