VEGF、Ki-67和TCF4在基底細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

張勝逆 康瑞花 張濤 趙建偉 丁秋允 趙桂香 張紅巖 劉春梅

·論著·

VEGF、Ki-67和TCF4在基底細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

張勝逆 康瑞花 張濤 趙建偉 丁秋允 趙桂香 張紅巖 劉春梅

目的探討VEGF、Ki-67、TCF4在基底細(xì)胞癌的表達(dá)模式及其之間的相關(guān)性，為臨床的預(yù)后判斷提供幫助。方法采用免疫組化方法和免疫印跡法對58例基底細(xì)胞癌和46例脂溢性角化病的標(biāo)本進(jìn)行檢測。結(jié)果VEGF、Ki-67、TCF4在基底細(xì)胞癌中的陽性率分別為60.10%(35/58)、83.27%(38/58)、91.07%(53/58)高于脂溢性角化病的26.20%(12/46)、27.39%(13/46)、21.74%(10/46)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；VEGF、Ki-67、TCF4在BCC表達(dá)顯著性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)。結(jié)論BCC的發(fā)生發(fā)展可能與VEGF、Ki-67、TCF4的異常高表達(dá)有關(guān)。

基底細(xì)胞癌；血管內(nèi)皮生長因子；Ki-67；T細(xì)胞因子4；免疫組化；免疫印跡

基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma，BCC)是源自表皮或其附屬器的皮膚惡性腫瘤，為最常見的皮膚惡性腫瘤之一[1-3]。BCC的好發(fā)部位以顏面部居多，盡管其惡性程度較低，但手術(shù)后可能會(huì)留有永久性瘢痕甚至出現(xiàn)容顏毀損，對患者生理和心理帶來極大的不利影響[4]，值得我們對BCC的病因和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入探討。目前其病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有研究報(bào)道BCC發(fā)病機(jī)制可能與WNT信號通路有關(guān)[5],本研究采用免疫組化和免疫印跡檢測血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、Ki-67、T細(xì)胞因子4(T cell factor 4，TCF4)在BCC及脂溢性角化病(seborrheic keratosis, SK)中的表達(dá)特征及相關(guān)性，更進(jìn)一步闡述血管生成因素、細(xì)胞增殖在BCC發(fā)生發(fā)展中的作用以及對于腫瘤惡性程度以及轉(zhuǎn)移、預(yù)后的影響，以進(jìn)一步探討B(tài)CC的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年10月至2016年2月于河北大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科和普外科就診并手術(shù)患者，結(jié)合臨床表現(xiàn)、病理確診為BCC和SK。選取58例BCC標(biāo)本，其中男32例，女26例;年齡47～82歲，平均年齡(57.2±3.2)歲；病程1.3～4年，平均(3.52±0.86)年。選取46例SK標(biāo)本作為對照組，其中男25例，女21例;年齡42～76歲，平均(55.4±3.1)歲。2組在年齡、性別比方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。同時(shí)對來自外科外傷患者切除的20例正常皮膚標(biāo)本進(jìn)行檢測。本研究通過河北大學(xué)附屬醫(yī)院的倫理委員會(huì)審批，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 小鼠抗人VEGF單克隆抗體，購自美國santa公司；小鼠抗人Ki-67單克隆抗體，購自美國santa公司；小鼠抗人TCF4單克隆抗體，購自美國santa公司；SP免疫組化系列工作液試劑盒，購自北京中杉公司；DAB顯色液，購自北京中杉公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化：石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，微波抗原修補(bǔ)，加入一抗為VEGF、Ki-67、TCF4(濃度1∶200，小鼠抗人單克隆一抗，美國santa公司)，4℃孵育12 h。二抗(兔抗小鼠)采用北京中杉公司S-P試劑盒，DAB(北京中杉公司)顯色經(jīng)蘇木素復(fù)染，脫水、透明后封片。每次染色均設(shè)陰性和陽性對照。采用 NIS-Elements Basic Research 多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)對VEGF、Ki-67、TCF4表達(dá)進(jìn)行定位觀察分析，每張切片分別觀察200倍及400倍視野圖像。

1.3.2 免疫印跡：取BCC及SK標(biāo)本組織100 mg，勻漿后低溫離心，應(yīng)用南京凱基全蛋白提取試劑盒提取總蛋白。測定蛋白濃度后聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，然后一抗4℃孵育12 h，二抗孵育后ECL顯色、曝光。對蛋白質(zhì)含量進(jìn)行密度分析，以相對灰度值代表蛋白表達(dá)量。

1.4 結(jié)果判定 VEGF以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞；Ki-67、TCF4陽性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞核著色，呈棕色、棕黃色。計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞密集域共10個(gè)，選擇400倍視野進(jìn)行陽性率的計(jì)算，取平均值，完全陰性或陽性率lt;10%者為(-)， 10%～25%為(+)， 26%～50%為(++)，gt;50%為(+++)。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 TCF4陽性為細(xì)胞核著色，TCF4 在正常上皮的基底部位細(xì)胞中有少數(shù)弱陽性表達(dá)，其他部位基本為陰性表達(dá)(圖1-1)。在BCC 組織細(xì)胞中，TCF4主要在細(xì)胞核呈弱陽性、陽性表達(dá)，并彌漫均勻的分布于整個(gè)腫瘤組織。在BCC皮損中53例陽性，陽性率為91.07% (圖1-2)；SK皮損10例陽性表達(dá), 陽性率為21.74%(圖1-3)。VEGF 在正常組織呈陰性表達(dá)(圖1-4)；在腫瘤部位的胞質(zhì)，胞膜及在間質(zhì)處均可見散在棕色顆粒，在BCC皮損中35例陽性，陽性率為60.10%(圖1-5)；SK皮損12例陽性表達(dá), 陽性率為26.20%(圖1-6)；Ki-67陽性為細(xì)胞核著色，Ki-67在正常皮膚組織的基底層、棘細(xì)胞層僅個(gè)別細(xì)胞有著色，為陰性表達(dá)(lt;5%)(圖1-7)；在 BCC 組織細(xì)胞中， Ki-67主要在細(xì)胞核呈弱陽性、陽性表達(dá)，在BCC皮損中38例陽性，陽性率為83.27%(圖1-8)；SK皮損13例陽性表達(dá)，陽性率為27.39%(圖1-9)；VEGF、Ki-67、TCF4在BCC皮損中的表達(dá)明顯高于SK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)(表1)。Spearman等級相關(guān)分析：Ki-67和TCF4呈正相關(guān)(rs=0.879，Plt;0.01)；VEGF和Ki-67呈正相關(guān)(rs=0.946，Plt;0.01)；VEGF和TCF4呈正相關(guān)(rs=0.756，Plt;0.01)。見圖1，表1。

圖1-1 TCF4在正常皮膚的表達(dá)

圖1-2 TCF4在BCC的表達(dá)

圖1-3 TCF4在SK的表達(dá)

圖1-4 VEGF在正常皮膚的表達(dá)

圖1-5 VEGF在BCC的表達(dá)

圖1-6 VEGF在SK的表達(dá)

圖1-7 Ki-67在正常皮膚的表達(dá)

圖1-8 Ki-67在BCC的表達(dá)

圖1-9 Ki-67在SK的表達(dá)

2.2 Western蛋白印跡結(jié)果 BCC組VEGF(1.41±0.015 vs 0.67±0.008)、KI-67(1.26±0.021 vs 0.54±0.012)、TCF4(1.08±0.007 vs 0.36±0.001)蛋白表達(dá)水平均明顯高于SK組(Plt;0.01)。見圖2，表2。

圖2 Western blot顯示VEGF、Ki-67、TCF4在BCC及SK中表達(dá)差異

組別VEGFKi-67TCF4BCC1.41±0.0151.26±0.0211.08±0.007SK 0.67±0.0080.54±0.0120.36±0.001P值3.56×10-56.22×10-67.85×10-4

3 討論

BCC是最常見的皮膚惡性腫瘤之一，好發(fā)于顏面部的暴露部位，隨著病程進(jìn)展腫瘤以浸潤性生長方式破壞鄰近組織，影響功能和美觀，嚴(yán)重時(shí)轉(zhuǎn)移至重要器官而危及生命，然而其確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，亟待解決[6-8]。

本研究在前期研究發(fā)現(xiàn)BCC的發(fā)生發(fā)展與WNT信號通路密切相關(guān)，在BCC的發(fā)病過程中存在WNT1、β-catenin的表達(dá)的異常升高，提示了這種異常表達(dá)模式可能是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的重要因素，其可能的通路作用與BCC的發(fā)生是密切相關(guān)的[9]。研究顯示W(wǎng)NT信號通路是調(diào)控細(xì)胞生長、增殖的重要信號通路，WNT-β-catenin-TCF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活可導(dǎo)致胚胎發(fā)育缺陷及多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]。研究發(fā)現(xiàn)，WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活與皮膚腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[11]。通路中的TCF基因家族(包含4個(gè)不同的蛋白TCF1、TCF3、TCF4和LEF)在正常組織發(fā)育和分化過程中起至關(guān)重要的作用，既能促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，又可抑制細(xì)胞過度生長，防止腫瘤發(fā)生[12]。其中，TCF4被證實(shí)為與腫瘤關(guān)系最密切的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子。研究報(bào)道，TCF4在肺癌，結(jié)腸癌，肝癌，腎癌，胃癌等腫瘤發(fā)生中表達(dá)明顯增強(qiáng)，推測異常升高的TCF4，刺激下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。

本研究采用免疫組化方法及免疫印跡的方法分別檢測了良、惡性角質(zhì)形成細(xì)胞腫瘤(脂溢性角化病、基底細(xì)胞癌)組織中TCF4的表達(dá)情況。本研究結(jié)果顯示：在基底細(xì)胞癌皮損中，TCF4在細(xì)胞核呈現(xiàn)不同程度的陽性表達(dá)，表達(dá)率高達(dá)陽性率為91.07%，而在脂溢性角化皮損及正常皮膚表皮全層表達(dá)顯著減低。Western blot也證實(shí)其在表達(dá)量上也存在著顯著性差異，這表明在BCC中TCF4的表達(dá)模式發(fā)生了異質(zhì)性改變，這種改變可能與BCC的發(fā)生相關(guān)。Zhao等[14]發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞系BEL-7402中TCF4呈高表達(dá)，楊連赫等[15]的研究表明TCF4在肺癌組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而在正常肺組織中不表達(dá)。在本研究中，TCF4在基底細(xì)胞癌和脂溢性角化病、正常皮膚組織中表達(dá)的強(qiáng)烈反差可推測TCF4的高表達(dá)與基底細(xì)胞癌的進(jìn)展密切相關(guān)，從而提示TCF4的表達(dá)水平能夠在一定程度上反映腫瘤細(xì)胞的活動(dòng)性，進(jìn)而推測TCF4的高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的惡性程度和分化程度有關(guān)。

有研究表明，當(dāng)WNT信號通路異常激活后， TCF4在WNT信號傳導(dǎo)中可調(diào)控下游基因表達(dá)[10]，進(jìn)一步激活c-myc、cyclinD1、TCF-1及Ki-67等，發(fā)揮進(jìn)一步的生物學(xué)功能。本研究中我們采用Spearman等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)TCF4和Ki-67呈正相關(guān)(rs=0.879，Plt;0.01)，這表明TCF4的異常高表達(dá)的直接結(jié)果之一是促進(jìn)了Ki-67的異常擴(kuò)增，促進(jìn)細(xì)胞過度增殖，細(xì)胞周期出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞分裂異常。Ki-67的表達(dá)與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)，隨細(xì)胞周期不同而發(fā)生改變，是反映腫瘤細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)。Ki-67 僅在增殖細(xì)胞的胞核中表達(dá)，半衰期短，脫離細(xì)胞周期后迅速降解，其表達(dá)高低是反應(yīng)腫瘤細(xì)胞增殖能力的重要參考之一[16]。研究證明，Ki-67的表達(dá)程度與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，表達(dá)越高其惡性程度及細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，只在少數(shù)正常上皮的基底部位有散在的細(xì)胞核弱陽性表達(dá)，其余幾乎均為陰性表達(dá)。而在基底細(xì)胞癌腫瘤組織細(xì)胞中陽性表達(dá)程度顯著增高38例陽性，陽性率為83.27%； SK皮損13例陽性表達(dá)，陽性率為27.39%。Western blot也證實(shí)其在表達(dá)量上也存在著明顯差異，說明在BCC可能在生物學(xué)本質(zhì)上并不傳統(tǒng)認(rèn)為具備所謂“惰性”，而是增殖程度較高的惡性腫瘤；并且其表達(dá)程度與TCF4呈正相關(guān)，說明在BCC的發(fā)生過程中在多種致癌因素作用下可能是由于TCF4的異常表達(dá)激活了Ki-67的高表達(dá)，從而使得基底細(xì)胞發(fā)生過度增殖而發(fā)生惡變。

腫瘤新生血管的形成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[17,18]，之前研究對于BCC中血管生成的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚BCC中VEGF蛋白的表達(dá)明顯高于SK組和對照組，本組資料顯示VEGF在BCC有較高的表達(dá)，陽性率為60.10%；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后顯示VEGF在BCC皮損中的表達(dá)明顯高于SK組，有顯著性差異；而在正常皮膚及幾乎不表達(dá)，這說明VEGF參與了BCC細(xì)胞間質(zhì)腫瘤微環(huán)境的代謝，為腫瘤的生長和進(jìn)一步浸潤提供了基礎(chǔ)，尤其是腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，它依賴于人體內(nèi)的新生血管。有研究顯示在在腫瘤細(xì)胞中，WNT-β-catenin-TCF通路可以通過靶向調(diào)節(jié)miR-23b而促進(jìn)VEGF的表達(dá)[19，20]，腫瘤的血管形成受到多種調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，其中血管內(nèi)皮生長因子VEGF作為最重要的血管生長因子之一。VEGF的生物學(xué)功能包括促進(jìn)血管形成和增加血管通透性，對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、基底膜水解、遷移和血管構(gòu)建的調(diào)控作用較強(qiáng)，且特異性高。近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，在一些腫瘤細(xì)胞上也存在VEGF受體的表達(dá)，提示腫瘤中可能存在VEGF的自分泌機(jī)制。有研究表明，人肝細(xì)胞癌組織中有VEGF的表達(dá)，且VEGF的表達(dá)于肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[19]。從而我們認(rèn)為，在BCC的發(fā)展過程中由于BCC腫瘤細(xì)胞不斷自分泌VEGF促進(jìn)了腫瘤微環(huán)境的形成，對其浸潤性生長和轉(zhuǎn)移提供了有力的條件。同時(shí)，我們對VEGF、Ki-67、TCF4兩兩之間進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，研究結(jié)果表明兩兩之間表達(dá)均呈正相關(guān)，由此可以推測VEGF、Ki-67、TCF4在功能上存在協(xié)同作用，一致性的高表達(dá)可能參與了BCC的發(fā)生。

本研究顯示，VEGF、Ki-67、TCF4在BCC的形成機(jī)制中可能起到一定的作用。可能三者之間通過協(xié)同作用改變WNT通路，導(dǎo)致細(xì)胞增值分化異常而致腫瘤發(fā)生。

1 Marzuka AG, Book SE. Basal cell carcinoma: pathogenesis, epidemiology, clinical features, diagnosis, histopathology, and management. Yale J Biol Med,2015,88:167-179.

2 Ruiz Salas V, Alegre M, Garcés JR,et al.Locally advanced and metastatic basal cell carcinoma: molecular pathways, treatment options and new targeted therapies. Expert Rev Anticancer Ther,2014,14:741-749.

3 Luz FB, Ferron C, Cardoso GP. Surgical treatment of basal cell carcinoma: an algorithm based on the literature. An Bras Dermatol,2015,90:377-383.

4 Nakamura Y, Teramoto Y, Tanaka R. Surgical management of umbilical basal cell carcinoma: Published work review and the optimal depth of surgical excision. J Dermatol,2014,41:992-995.

5 康瑞花,張勝逆,李美洲,等. Wnt1在基底細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義.中國麻風(fēng)皮膚病雜志,2010,26:34-35.

6 Sofen H, Gross KG, Goldberg LH.A phase Ⅱ, multicenter, open-label, 3-cohort trial evaluating the efficacy and safety of vismodegib in operable basal cell carcinoma.J Am Acad Dermatol,2015,73:99-105.

7 Longo C, Lallas A, Kyrgidis A.Classifying distinct basal cell carcinoma subtype by means of dermatoscopy and reflectance confocal microscopy. J Am Acad Dermatol,2014,71:716-724.

8 Ozgur OK, Yin V, Chou E.Hedgehog Pathway Inhibition for Locally Advanced Periocular Basal Cell Carcinoma and Basal Cell Nevus Syndrome. Am J Ophthalmol,2015,160:220-227.

9 張勝逆,康瑞花,高順強(qiáng). WNT信號傳導(dǎo)通路與基底細(xì)胞癌關(guān)系的研究.河北醫(yī)科大學(xué),2009.

10 Sun X, He Y, Huang C.Distinctive microRNA signature associated of neoplasms with the Wnt/β-catenin signaling pathway. Cell Signal,2013,25:2805-2811.

11 Engeland M, van Steensel MA.Epigenetic changes in Basal Cell Carcinoma affect SHH and WNT signaling components. PLoS One,2012,7:e51710.

12 Wang Y, Liu S, Zhu H.FRAT1 overexpression leads to aberrant activation of beta-catenin/TCF pathway in esophageal squamous cell carcinoma. Int J Cancer,2008,123:561-568.

13 Jamieson C, Sharma M, Henderson BR. Targeting the β-catenin nuclear transport pathway in cancer. Semin Cancer Biol,2014,27:20-29.

14 Zhao DH, Hong JJ, Guo SY, et al. Aberrant expression and function of Tcf4 in the proliferation of hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402. Cell Res,2004,14:74-80.

15 楊連赫,徐洪濤,王恩華.TCF-4在肺癌中高表達(dá)并與肺癌的進(jìn)展有關(guān).中國肺癌雜志,2008,11:214-219.

16 Arima N, Nishimura R, Osako T.The importance of tissue handling of surgically removed breast cancer for an accurate assessment of the Ki-67 index.J Clin Pathol,2016,69:255-259.

17 Chen JX, Deng N, Chen X.A novel molecular grading model: combination of Ki67 and VEGF in predicting tumor recurrence and progression in non-invasive urothelial bladder cancer. Asian Pac J Cancer Prev,2012,13:2229-2234.

18 Sobjanek M, Zabotna M, Lesiak A.The -1154 G/A VEGF gene polymorphism is associated with the incidence of basal cell carcinoma in patients from northern Poland. Arch Dermatol Res,2014,306:539-544.

19 Chen L,Han L,Zhang K,et al.VHL regulates the effects of miR-23b on glioma survival and invasion via suppression of HIF-1α/VEGF and β-catenin/Tcf-4 signaling.Neuro Oncol,2012,14: 1026-1036.

20 Hwang I,Kim J,Jeong S.β-Catenin and peroxisome proliferator-activated receptor-δ coordinate dynamic chromatin loops for the transcription of vascular endothelial growth factor Agene in colon cancer cells. J Biol Chem,2012,30:41364-41373.

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.22.016

071000 河北省保定市，河北大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科(張勝逆、趙建偉、丁秋允、趙桂香、張紅巖、劉春梅)，胃腸外科(張濤)；河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科(康瑞花)

康瑞花，050011 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科；

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A

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2016-04-16)