MED1的表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞特性的影響

鄭元慧 董男男

MED1的表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞特性的影響

鄭元慧 董男男

目的研究卵巢癌細(xì)胞中MED1的表達(dá)對細(xì)胞生長、遷移以及侵襲能力的影響。方法通過分子手段獲得MED1沉默型卵巢癌細(xì)胞B7-D5與C4-E8，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)以及通過流式細(xì)胞儀測定分析細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)，與MED1表達(dá)型卵巢癌細(xì)胞比較細(xì)胞生長特性；進(jìn)行Transwell遷移以及侵襲實(shí)驗(yàn)，對比細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。結(jié)果MED1沉默型卵巢癌細(xì)胞胞體外生長受到抑制，克隆數(shù)目急劇降低，被阻滯在G0/G1期的細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞數(shù)目減少，遷移以及侵襲能力降低。結(jié)論MED1的沉默表達(dá)可以有效抑制卵巢癌細(xì)胞的生長以及遷移，為研發(fā)治療卵巢癌的靶向藥物奠定基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄中介體1；卵巢癌；細(xì)胞生長特性

作者單位：250022 濟(jì)南，山東濟(jì)南循證醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部

卵巢癌是全球女性生殖系統(tǒng)死亡率最高的惡性腫瘤疾病。據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計(jì)，2012年美國新發(fā)卵巢癌病例22,280例，新死亡病例15,500例[1]。在我國所有婦科惡性腫瘤中，卵巢癌的發(fā)病率第3位，而死亡率卻居首位[2]。目前，對于卵巢癌的治療主要分為手術(shù)和化療兩種方法。手術(shù)治療與化療對患者身體傷害極大，并且復(fù)發(fā)率高，這就迫切需要卵巢癌治療的新方法。近幾年，隨著越來越多的證據(jù)支持腫瘤干細(xì)胞假說，干細(xì)胞療法也逐漸成為研究卵巢癌治療的熱門領(lǐng)域[3-6]。與此同時，通過研究卵巢癌細(xì)胞生長以及轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因治療方法也成為全球?qū)W者研究的重點(diǎn)[7]。

本文即通過細(xì)胞分子生物學(xué)的方法，獲得MED1沉默型卵巢癌細(xì)胞，研究其與正常卵巢癌細(xì)胞在細(xì)胞生長特性以及遷移和侵襲能力上的改變情況，揭示MED1在卵巢癌細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移過程中起到的作用，為研發(fā)治療卵巢癌的靶向性藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人卵巢癌細(xì)胞OVA-1，購于美國ATCC公司；MED1沉默型人卵巢癌細(xì)胞B7-D5與C4-E8，均本實(shí)驗(yàn)室自行制備；胎牛血清（FBS），購于Gibco公司；DEME培養(yǎng)基，購買于Gibco公司；胰蛋白酶，購于OXOID公司；DMSO，購于天津希為化工有限公司；無水乙醇、甲醛以及結(jié)晶紫染液，購于天津希為化工有限公司；所有試劑皆為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 6孔板、24孔板與96孔板，購買于Thermo公司；酶標(biāo)儀，夠買于Bio-Rad公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱，購買于美國施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，購買于上海申安醫(yī)療器械廠；流式細(xì)胞儀，購買于FACSCalibur、BD Biosciences（美國）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT） 將細(xì)胞以每個孔200 μL接種于96孔板中（5×103個/孔-8×103個/孔），分別常規(guī)培養(yǎng)（37oC與5%CO2）2 d、4 d與6 d后，加入MTT（5 mg/mL,20 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸取上清培養(yǎng)液，加入100 μL/孔的DMSO，振蕩10 min，選取490 nm波長用酶標(biāo)儀測定OD值。

1.3.2 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn) 取細(xì)胞2×103個/mL，接種于6孔板中，毎孔2 mL，每隔3 d換液一次，常規(guī)培養(yǎng)3周左右，當(dāng)孔中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，停止培養(yǎng)，吸取上清培養(yǎng)液，PBS洗2遍，加入4%甲醛進(jìn)行固定，固定時間為15 min，吸取上清液，0.25%的結(jié)晶紫染色25 min，無菌水緩慢沖洗，置于無菌超凈臺中進(jìn)行干燥，干燥后進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)。

1.3.3 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 取細(xì)胞約1×106個，懸于PBS中，用700 μL無水乙醇（預(yù)冷）旋轉(zhuǎn)固定3 h左右，500 μL PI染色液37oC溫育30 min，然后用40 μm尼龍網(wǎng)膜進(jìn)行過濾，流式細(xì)胞儀（488 nm波長處檢測紅色熒光）與ModfFitLT軟件測量各個周期細(xì)胞所占比例。

1.3.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期細(xì)胞無血清培養(yǎng)1 d，制備無血清細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度1×105個/mL），以上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含10%FBS培養(yǎng)液接種于24孔板小室中，常規(guī)培養(yǎng)1 d左右進(jìn)行固定與染色（加入4%甲醛進(jìn)行固定，固定時間為15 min，吸取上清液，0.25%的結(jié)晶紫染色25 min，無菌水緩慢沖洗，置于無菌超凈臺中進(jìn)行干燥，干燥后進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)）。

1.3.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) BD Matrigel于4oC過夜，基質(zhì)膠與無FBS培養(yǎng)液按1:5配置工作液，加入24孔板小室的上室中（60 μL/孔），37oC，2 h，其他同1.3.4。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT）結(jié)果 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.3.1所示進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以時間為橫坐標(biāo)，酶標(biāo)儀測定的OD值為縱坐標(biāo)繪制不同細(xì)胞生長曲線圖，如圖1所示。其中B7-D5與C4-E8為本實(shí)驗(yàn)室篩選的MED1沉默型卵巢癌細(xì)胞，OVA-1為MED1表達(dá)型卵巢癌細(xì)胞。由圖1可知，MED1表達(dá)沉默型的卵巢癌細(xì)胞（B7-D5與C4-E8）與MED1表達(dá)型細(xì)胞相比生長明顯減慢，說明MED1沉默表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞的生長具有抑制作用。

2.2 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.3.2所示進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞板倒置拍照，用肉眼計(jì)數(shù)細(xì)胞形成的克隆數(shù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖2所示。B7-D5和C4-E8細(xì)胞克隆數(shù)的統(tǒng)計(jì)與OVA-1細(xì)胞克隆數(shù)的統(tǒng)計(jì)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。可見MED1表達(dá)沉默型的卵巢癌細(xì)胞（B7-D5與C4-E8）與MED1表達(dá)型細(xì)胞相比，在細(xì)胞培養(yǎng)板上形成克隆的數(shù)目急劇減少。

2.3 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.3.3所示進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在同時檢測光散射情況，利用ModfFitLT軟件，根據(jù)FL2-A直方圖分析細(xì)胞周期中G0/G1、S、G2期細(xì)胞的比例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。可見MED1表達(dá)沉默型細(xì)胞B7-D5與C4-E8處于G0/G1期的數(shù)目明顯多于MED1表達(dá)的細(xì)胞OVA-1（P＜0.001），與此相對應(yīng)的進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，說明MED1沉默表達(dá)對于卵巢癌細(xì)胞分裂周期起到抑制作用，因此可以抑制卵巢癌細(xì)胞的生長。

2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.3.4所示進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。OVA-1細(xì)胞相對遷移為1.00，B7-D5與C4-E8遷移能力分別為0.20和0.22，與OVA-1相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見MED1表達(dá)沉默型細(xì)胞B7-D5與C4-E8遷移能力明顯降低。

2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.3.4所示進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。OVA-1細(xì)胞相對遷移為1.00，B7-D5與C4-E8遷移能力分別為0.16和0.17，與OVA-1相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明MED1表達(dá)沉默型細(xì)胞B7-D5與C4-E8侵襲能力明顯降低。

3 結(jié)論

MED1是中介體復(fù)合物（Mediator Complex）的一種，是Mediator在哺乳動物中最為重要的一個亞基，又被稱之為PBP、RB18A等[8]。作為Mediator最為重要的亞基，同時也是研究最多的亞基，MED1與Mediator一樣也是mRNA合成過程中起早關(guān)鍵性的作用[9]。它能通過MAPK、PDK/Akt途徑實(shí)現(xiàn)磷酸化激活，并與其他共調(diào)控因子，一同調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，起到控制細(xì)胞生長的作用[10]。此前，有學(xué)者[11]研究完全敲除小鼠MED1基因，在培養(yǎng)小鼠11.5 d后，發(fā)現(xiàn)小鼠的胎盤以及心血管出現(xiàn)功能低下、發(fā)育缺陷等病癥。Hasegawa[12]與Cui[13]等研究MED1沉默型乳腺癌細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，MED1沉默表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞生長較正常細(xì)胞明顯受到抑制。本研究也發(fā)現(xiàn)，MED1沉默型卵巢癌細(xì)胞的生長也明顯受到抑制。

圖1 MED1的表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞體外生長的影響

圖2 MED1的表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞克隆形成的影響

圖3 MED1的表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞周期的影響

圖4 MED1表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞遷移能力的影響

圖5 MED1表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的影響

侵襲轉(zhuǎn)移是造成腫瘤患者治療失敗甚至死亡的最主要因素[14]。而Shuman等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的遷移及侵襲都與MMPS的表達(dá)和活化有關(guān)。MED1是與SCR以及CBP一樣都具有LXXLL結(jié)構(gòu)域，并且是核受體的共激活因子的轉(zhuǎn)錄因子。有研究[16-18]表明SCR、CBP可以通過控制MMPS的表達(dá)調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本文研究MED1沉默型卵巢癌細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力降低，說明MED1也可以調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，MED1在卵巢癌細(xì)胞的生長以及轉(zhuǎn)移過程中起到重要的作用。MED1的沉默表達(dá)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的生長以及轉(zhuǎn)移，對治療卵巢癌具有十分重要的意義。

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Effect of the expression MED1 on ovarian cell

Yuanhui ZHENG,Nannan DONG
Department of Basic Medicine,Ji'nan Evidence Based Medical Science Research Center of Shandong,Ji'nan 250022,China

ObjectiveTo explore the effect of the expression MED1 on the cell growth,migration and invasion abilities was studied.MethodsBased on the MTT experiments,cell clones experiments,the analysis of cell cycle experiments by Flow Cytometry,Transwell migration and invasion experiments,comparing the MED1 silent and the expression of ovarian cancer in the character of cell growth and the change of cell migration and invasion.ResultsComparing with normal ovarian cancer,the MED1 silent cell growth was inhibited,the number of clones were reduced,cells in G0/G1phase were increased significantly and cells in S phase were reduced,the ability of cells migration and invasion was reduced.ConclusionSilencing the expression of MED1 can effectively inhibit ovarian cancer cell growth and migration,which layed the foundation for the development of targeted drugs to treat ovarian cancer.

MED1; Ovarian cancer; Growth characteristics of the cells