耐喹諾酮類銅綠假單胞菌的耐藥分子機制研究

李玲 周飛

耐喹諾酮類銅綠假單胞菌的耐藥分子機制研究

李玲 周飛

目的探討耐喹諾酮類銅綠假單胞菌的耐藥分子機制。方法選取我院2013年1月-2015年7月收集的100例耐喹諾酮類銅綠假單胞菌株，采用PCR技術培養，并將培養收集的菌株點狀種植在平板培養基上，培養基是由制備的耐喹諾酮類藥物組成。對耐藥銅綠假單胞菌株中的gyrA、gyrB、parC和parE基因的表達情況進行檢測；將100例培養的銅綠假單胞菌株培養液，每份分為等量兩份（每份100例），并將所有的銅綠假單胞菌株接種在含有耐喹諾酮類藥物的平板培養基上，其中一份接受常規培養，為對照組，一份放入含有羰基氫氯苯腙（carbonyl hydroch lorophenylhydrazone,CCCP）培養基中進行培養，為觀察組，對其耐藥性進行分析。結果gyrA的基因表達率為75.00%，parC的基因表達率為74.00%，明顯高于gyrB的基因表達率（23.00%）和parE的基因表達率（22.00%），差異有統計學意義（P＜0.05）。觀察組中存活菌株數48例（48.00%），明顯低于對照組［70例（70.00%）］，差異有統計學意義（P＜0.05） 。結論銅綠假單胞菌耐喹諾酮類藥物的主要機制是gyrA、parC兩種基因的表達，其次銅綠假單胞菌的主動泵出系統也是其耐藥性的一個重要機制。在臨床中應熟悉菌株的耐藥機制，選擇合理的抗菌藥物，可降低臨床用藥的不良事件的危險性，提高治療療效，延長抗菌藥物的使用壽命。

反耐喹諾酮類；銅綠假單胞菌；耐藥

作者單位：528459 中山，中山市板芙醫院

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PAE）是臨床上引起感染較為多見的病原菌之一，也是造成醫院嚴重感染和常見的致病條件菌，且感染率在近幾十年呈逐漸上升的趨勢[1]。隨著喹諾酮類廣譜抗菌藥物在臨床的廣泛應用，銅綠假單胞菌對喹諾酮類廣譜抗菌藥物的耐藥性逐漸增強，使得控制、治療銅綠假單胞菌引起的感染變得尤為困難[2]。目前臨床公認為銅綠假單胞菌對喹諾酮類廣譜抗菌藥物的主要耐藥機制包括外膜孔蛋白的通透性下降、藥物作用的靶位改變、外排泵的主動外排及由介質介導的耐藥機制[3]。而由染色體介導引起的對喹諾酮類廣譜抗菌藥物耐藥性只能由親代垂直傳給子代，且具有在不同菌株間不易傳播及傳播速度慢等特點[4]。但是近幾年銅綠假單胞菌對喹諾酮類廣譜抗菌藥物的耐藥上升速度較快，故可能發生由可移動元件如質粒介導的耐藥基因的水平轉移[5]。為了研究耐喹諾酮類銅綠假單胞菌的耐藥分子機制，為臨床選擇合理用藥提供理論基礎，本研究對100株耐喹諾酮類銅綠假單胞菌進行喹諾酮類藥物耐藥基因檢測，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取我院2013年1月-2015年7月收集的100例耐喹諾酮類銅綠假單胞菌株，其中30株標本從患者的痰液中分離，30株標本從患者的胸水中分離，20株標本從患者的血液中分離，20株標本從患者的尿液中分離。所有的菌株均經VITEK-AMS鑒定，最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）均≥4 μg/mL。質控菌株均為銅綠假單胞菌株。

1.2 方法 對收集的100株耐喹諾酮類銅綠假單胞菌采用PCR技術培養，并將培養收集的菌株點狀種植在平板培養基上，培養基由制備的耐喹諾酮類藥物組成。對耐藥銅綠假單胞菌株中的gyrA、gyrB、parC和parE基因的表達情況進行檢測。

將100例培養的銅綠假單胞菌株培養液，每份分為等量兩份（每份100例），并將所有的銅綠假單胞菌株接種在含有耐喹諾酮類藥物的平板培養基上，其中一份接受常規培養，為對照組，一份放入含有羰基氫氯苯腙（carbonyl hydrochlorophenylhydrazone,CCCP）培養基中進行培養，為觀察組，并將濃度增加至5 mg/L（此濃度對抑制外排泵可起到有效的作用，但對細菌生長無抑制作用），在檢測CCCP存在的基礎上，觀察兩組中銅綠假單胞菌株的生長作用。

1.3 觀察指標 觀察、檢測并比較所有培養基中gyrA、gyrB、parC和parE基因的表達情況、加入CCCP后各菌株的生存情況及gyrA、gyrB、parC和parE基因的表達情況。

1.4 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（Mean±SD）表示，采用t檢驗，計數資料采用率（%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1gyrA、gyrB、parC和parE基因的表達情況比較gyrA的基因表達率為75.00%，parC的基因表達率為74.00%，明顯高于gyrB的基因表達率（23.00%）和parE的基因表達率（22.00%），差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 兩組銅綠假單胞菌株生長情況的比較 觀察組中存活菌株數48例（48.00%），明顯低于對照組［70例（70.00%）］，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 100例培養基中gyrA、gyrB、parC和parE基因的表達比較

表2 兩組樣本中銅綠假單胞菌株生長情況比較

3 討論

銅綠假單胞菌是目前醫院內引起嚴重感染的主要病原菌之一，臨床資料[6]表明被銅綠假單胞菌感染的患者預后較差。隨著社會的發展、生活水平的提高及人們的健康理念的增強，抗生素在臨床廣泛應用，甚至達到濫用的程度，引起銅綠假單胞菌對多種廣譜抗菌藥物逐漸產生耐藥性，最終導致感染較難控制，對治療效果造成影響。隨著耐藥機制研究的不斷深入，銅綠假單胞菌對喹諾酮類廣譜抗菌藥物的主要耐藥機制是使靶位點出現改變及外排泵的主動外排和由介質介導的耐藥機制[7]。其中靶位點的主要改變包括編碼DNA促旋酶的gyrA及gyrB基因和編碼DNA拓撲異構酶IV上的parC和parE基因突變。主動泵出系統的組成成分包括連接蛋白、外膜蛋白及內膜蛋白，而外排泵抑制劑CCCCP可有效抑制銅綠假單胞菌的主動泵出系統[8]。

本研究中，通過對100例銅綠假單胞菌株采取常規培養，并對染色體介導的gyrA、gyrB、parC和parE耐藥基因進行檢測，結果示：gyrA的基因表達率為75.00%，parC的基因表達率為74.00%，明顯高于gyrB基因（23.00%）和parE基因（22.00%），差異有統計學意義（P＜0.05）。編碼DNA促旋酶中的gyrA、parC基因存在高表達，這表明銅綠假單胞菌對喹諾酮類廣譜抗菌藥物耐藥性的發生和gyrA、parC的基因突變有較大的關聯及臨床指導意義。因CCCP可有效抑制主動泵出系統，故在加入CCCP的觀察組樣本中，耐藥菌的生存率明顯低于未加入CCCP的對照組，本研究結果顯示：觀察組中存活菌株數48例（48.00%），明顯低于對照組［70例（70.00%）］，差異有統計學意義（P＜0.05）。可見銅綠假單胞菌的主動泵出系統也是銅綠假單胞菌產生耐藥性的一個重要因素。

有文獻[9]報道在編碼DNA拓撲異構酶IV上的parC和parE基因的表達量和銅綠假單胞菌對喹諾酮類廣譜抗菌藥物耐藥性的相關性研究中，他們之間呈明顯相關性，有明顯的臨床指導意義，故公認為編碼DNA拓撲異構酶IV上的parC和parE基因的突變也是引起銅綠假單胞菌對喹諾酮類廣譜抗菌藥物產生耐藥性的主要原因。而喹諾酮類藥物作用的包括拓撲異構酶IV和DNA旋轉酶，這兩個酶均是細菌正常生長所必需的酶，兩者中任何一種酶受到破壞或抑制均會對細菌的繁殖生長造成影響，引起細菌死亡[10]。DNA旋轉酶屬于II型拓撲異構酶，可催化閉環DNA負螺旋化，是ATP酶的能量依賴性酶，其組成成分包括CyrA、CyrB，分別是由gyrA、gyrB基因編碼。CyrB可連接ATP參與能量傳遞，而CyrA可介導DNA發生斷裂，其再與DNA連接，是DNA復制過程中所必需的酶。拓撲異構酶IV組成結構包括2個E亞單位和2個C亞單位，所對應的基因編碼分別為parE和parC，二者蛋白質在核酸序列及氨基酸序列上均與DNA旋轉酶相似。拓撲異構酶IV和DNA旋轉酶的變異可引起細菌對喹諾酮類廣譜抗菌藥物產生耐藥性。而這些耐藥編碼基因gyrA、gyrB、parC和parE在氨基酸的序列及核苷酸順序上均有很大的相似性。在gyrA和parC基因中存在一個被命名為熱點的喹諾酮類耐藥決定區（quinolone resislance determining,QRDR）[11]。有文獻[12,13]在對銅綠假單胞菌及大腸埃希菌的研究中發現，熱點是gyrA內87位的門冬氨酸及83位的絲氨酸及parC內83位門冬氨酸和79位的絲氨酸。正是因為這些氨基酸的改變而引起細菌對抗菌藥物產生耐藥性及敏感性下降。而細菌的gyrB、parE編碼基因較少發生突變[14,15]。

綜上所述，銅綠假單胞菌耐喹諾酮類藥物的主要機制是gyrA、parC兩種基因的表達，其次銅綠假單胞菌的主動泵出系統，故在臨床中應熟悉菌株的耐藥機制，選擇合理的抗菌藥物，可降低臨床用藥的不良事件的危險性，提高治療療效，延長抗菌藥物的使用壽命。

1 李梅,王文香,潘發憤,等.銅綠假單胞茵質粒介導的喹諾酮耐藥機制研究.浙江醫學,2016,38(1): 29-31.

2 邸秀珍,王睿.耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌耐藥機制的研究現狀.中國臨床藥理學雜志,2015,14(8): 669-672.

3 滕國杰,聶秀紅,楊強.亞胺培南/西司他丁和美羅培南治療機械通氣患者痰分離銅綠假單胞菌的耐藥風險差異.中國感染控制雜志,2016,15(6): 397-400.

4 楊祚明,譚孟源,符春花,等.多重耐藥銅綠假單胞菌外排泵基因表達與耐藥表型和耐藥程度的關系.中華實用診斷與治療雜志,2016,30(1): 86-88.

5 賀爾.綜合性醫院銅綠假單胞菌的臨床分布及耐藥趨勢分析.中國消毒學雜志,2015,32(9): 931-933.

6 蔣月婷,黃松音,吳愛武,等.耐喹諾酮類銅綠假單胞菌的耐藥機制研究.熱帶醫學雜志,2010,10(7): 780-783.

7 楊曉燕,張永標,梁彩倩,等.質粒介導銅綠假單胞菌對喹諾酮類耐藥機制的研究.中華醫院感染學雜志,2013,23(11):2524-2526.

8 楊曉燕,張永標,梁彩倩,等.耐環丙沙星銅綠假單胞菌的耐藥性及耐藥機制研究.中華醫院感染學雜志,2013,23(19):4609-4612.

9 巴兆粉,楊洪江,林書祥.一株銅綠假單胞菌臨床菌株耐藥的分子機制研究.臨床兒科雜志,2012,30(6): 515-518.

10 張國棟,曾章銳,王瑩,等.gyrA、gyrB和外排系統共同介導銅綠假單胞菌對喹諾酮類耐藥機制研究.中國感染與化療雜志,2014,14(3): 224-228.

11 明德松,蘇智軍,朱炎.泛耐藥銅綠假單胞菌喹諾酮類5種耐藥相關基因研究.中華醫院感染學雜志,2014,24(16):3912-3914.

12 閆玉蘭,郭世輝,李萌,等.耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥機制研究.中華醫院感染學雜志,2014,24(15): 3650-3652.

13 孫震,殷俊,高偉,等.耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥機制研究.中國抗生素雜志,2009,34(1): 52-56.

14 劉偉,侯麗萍,趙良娟,等.環介導等溫擴增技術檢測食品中銅綠假單胞菌.食品研究與開發,2012,33(5):140-142.

15 沈定霞,羅燕萍,崔巖.分離產金屬β-內酰胺酶的銅綠假單胞菌.中華醫院感染學雜志,2004,14(1): 90-92.

Study on molecular mechanism of resistance to quinolone-resistantPseudomonas aeruginosa

Ling LI,Fei ZHOU
Banfu Hospital of Zhongshan City,Zhongshan 528459,China

ObjectiveTo study the molecular mechanism of resistance to quinolone-resistantPseudomonas aeruginosa.MethodsFrom January 2013 to July 2015 in Banfu Hospital of Zhongshan City,100 strains of quinolone-resistantPseudomonas aeruginosawere cultured by PCR and the collected strains were planted on plate culture medium.The medium was composed of quinolones.The expressions ofgyrA,gyrB,parCandparEgenes in resistantPseudomonas aeruginosastrains were detected.The resistant strains were analyzed by adding carbonyl hydrochlorophenylhydrazone (CCCP).ResultsThe gene expression rate ofgyrAwas 75.00%; the gene expression rate ofparCwas 74.00%,which was significantly higher than that ofgyrBgene (23.00%) andparEgene(22.00%),with significant differences (P＜0.05).The number of viable strains in the observation group (48.00%)was significantly lower than that in the control group (70.00%),and the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe main mechanism of quinolones is the expression ofgyrAandparC,and the active pumping system ofPseudomonas aeruginosais also an important mechanism of drug resistance.Therefore,be familiar with the drug resistance mechanism and a reasonable antimicrobial drugs selection could reduce the risk of adverse events and improve the clinical efficacy.

Quinolones;Pseudomonas aeruginosa; Drug resistance