雷公藤甲素在LPS誘導的急性葡萄膜炎中的抗炎作用*

蘇映雪， 王延東， 甄棟欽， 曹 琛

(中山大學中山眼科中心， 眼科學國家重點實驗室， 廣東 廣州 510060)

雷公藤甲素在LPS誘導的急性葡萄膜炎中的抗炎作用*

蘇映雪， 王延東△， 甄棟欽， 曹 琛

(中山大學中山眼科中心， 眼科學國家重點實驗室， 廣東 廣州 510060)

目的觀察雷公藤甲素對細菌脂多糖(LPS)誘導的急性葡萄膜炎(LIU)的抗炎作用。方法BALB/c小鼠24只，隨機分為空白對照組、模型組和雷公藤甲素組，每組8只，雷公藤甲素組給予0.05%雷公藤甲素滴眼液，空白對照組和模型組均給予等體積的生理鹽水。連續給藥30 d后，除空白對照組外各組小鼠于玻璃體腔內注射125 mg/L的LPS建立LIU模型。分別在造模后12、24、48和72 h后，對各組小鼠眼前節進行裂隙燈檢查，并對眼組織進行病理學觀察，同時提取眼組織蛋白，ELISA法檢測眼組織中細胞間黏附分子1(ICAM-1)、白細胞介素1β(IL-1β)和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的水平。結果造模24 h后，與模型組相比，雷公藤甲素組能明顯減輕LIU引起的炎癥反應并降低炎癥臨床評分，差異有統計學意義(P<0.01)。組織病理學也表明雷公藤甲素對小鼠前房、玻璃體腔內的炎癥細胞浸潤以及視網膜水腫增厚有明顯的抑制作用。同時，ELISA結果顯示雷公藤甲素顯著下調眼組織中ICAM-1、IL-1β和MCP-1的表達，差異有統計學意義(P<0.05)。結論雷公藤甲素可能通過下調炎癥細胞因子表達，從而減輕葡萄膜炎的眼部組織損傷，為葡萄膜炎的治療提供了新的免疫療法。

雷公藤甲素； 葡萄膜炎； 炎癥細胞因子

葡萄膜炎(uveitis)是一種累及葡萄膜、視網膜、視網膜血管及玻璃體的常見眼部炎癥性疾病，多發生于青壯年及少年兒童，在致盲眼病中有重要地位。葡萄膜炎的發病機制十分復雜，主要認為革蘭氏陰性細菌感染是其發病的始動因素。目前臨床上治療葡萄膜炎的主要藥物包括糖皮質激素和免疫抑制劑，雖然有一定療效，但長期應用常常會導致全身及眼部毒副作用，而且停藥后易復發，最終致使視功能下降或視力喪失[1-2]。因此，尋找安全有效的治療藥物是葡萄膜炎研究領域中一項迫切的任務。本研究采用細菌脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)誘導的葡萄膜炎(LPS-induced uveitis，LIU)模型為研究對象，探討雷公藤甲素(triptolide，TP)對急性葡萄膜炎的抗炎作用。

材 料 和 方 法

1主要試劑及儀器

0.05% TP滴眼液(中山大學中山眼科中心制劑室)；傷寒桿菌脂多糖(Sigma)；細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、白細胞介素1β(interleukin-1，IL-1β)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1) ELISA試劑盒及蘇木素-伊紅染色劑(武漢博士德生物工程有限公司)。手術顯微鏡(Leica)；裂隙燈數碼圖像處理系統(Topcon)；熒光顯微鏡(Olympus)；酶標儀(BioTek)。

2實驗動物及分組

SPF級健康雄性BALB/c小鼠24只，購于廣東省醫學實驗動物中心，6～8周齡，體重20 g左右。隨機分為空白對照(control)組、模型(LPS)組和TP(TP+LPS)組，每組8只。

3方法

3.1LIU模型的建立[3]及給藥 前期預試驗選取0.0125%、0.025%和0.05%的TP滴眼液給藥30 d，發現0.05% TP滴眼液對LPS誘導的急性葡萄膜炎具有抑制作用，因此，本實驗選取0.05% TP滴眼液給藥進行實驗研究。具體給藥方法是空白對照組和模型組均給予生理鹽水，TP組給予等體積的0.05% TP滴眼液，每間隔2 h給藥1次，每天共4次。連續給藥30 d后，除空白對照組外各組小鼠于玻璃體腔內注射LPS(125 mg/L)2 μL，建立了LIU小鼠模型。

3.2裂隙燈觀察及評分 分別于造模后12、24、48和72 h對各組小鼠眼前節用裂隙燈顯微鏡觀察炎癥反應，拍照并詳細記錄臨床體征。炎癥分級具體的評分標準[4]：虹膜充血(0～3分)、前房滲出(0～2分)、前房積膿(0～1分)、瞳孔縮小(0～1分)，總分為7分。

3.3組織病理學觀察 造模24 h后，每組隨機麻醉處死3只小鼠，立即取出雙眼眼球，并將眼球置于4%多聚甲醛固定液中，4 ℃過夜。次日，依次進行蔗糖梯度脫水包埋，制作眼球石蠟組織切片，厚度為4 μm，進行HE染色，于熒光顯微鏡下拍照觀察，并在高倍鏡視野下統計虹膜睫狀體和玻璃體腔內浸潤的炎癥細胞數，取3張切片炎癥細胞計數的平均值為該眼球炎癥細胞浸潤數。

3.4細胞因子測定 將新鮮分離的虹膜睫狀體及視網膜組織置于液氮中研磨，每100 mg組織加入0.5 mL裂解液，冰浴下超聲充分破碎細胞，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液。嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，最后將樣品置于酶標儀讀取波長為450 nm的吸光度A值，檢測造模24 h后組織中ICAM-1、IL-1β和MCP-1的水平。

4統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。所有實驗數據均以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1TP對LIU眼前節炎癥反應的影響

裂隙燈下可見空白對照組小鼠眼部無葡萄膜炎體征；模型組在造模12 h后，眼前節出現典型的葡萄膜炎體征，包括虹膜充血、房水閃輝及前房炎性滲出等，24 h后炎癥反應達到高峰，前房積膿明顯、瞳孔顯著縮小甚至瞳孔膜閉，量化評分為6.53±0.45，相對于正常組(0.11±0.01)明顯增高(P<0.01)，證明葡萄膜炎造模成功；TP組小鼠眼部偶見輕度的虹膜充血，前房見少量纖維素樣滲出，無前房積膿，量化評分為3.38±0.37，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。造模48 h后，眼前節炎癥反應急劇下降，72 h后炎癥反應幾乎完全消失，見圖1。

2TP對LIU眼組織病理形態的影響

眼球石蠟組織切片HE染色結果可見，空白對照組虹膜睫狀體和視網膜各層結構完整正常，前房、視網膜及玻璃體腔內均未見炎癥細胞；模型組虹膜睫狀體組織及前房內見大量炎癥細胞浸潤及纖維素樣滲出，視網膜內表面可見玻璃體腔內炎癥絮狀滲出及大量炎癥細胞浸潤，視網膜水腫增厚并伴有血管炎癥反應；TP組虹膜睫狀體和玻璃體腔內僅有少量炎癥細胞浸潤。與模型組相比，TP組虹膜睫狀體處炎癥細胞數減少69.17%，玻璃體腔內炎癥細胞數減少58.93%，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 1. The typical signs and clinical score of uveitis in each group. A: control group; B: LPS group; C: TP+LPS group. Arrows indicate anterior chamber empyema. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsB.

圖1各組小鼠裂隙燈下葡萄膜炎體征及量化評分

Figure 2. The histological examination and inflammatory cell counting in each group. A: control group; B: LPS group; C: TP+LPS group. Arrows indicate inflammatory cells and neovascularization. Mean±SD.n=6 .**P<0.01vsB.

圖2各組小鼠眼球病理切片及炎癥細胞計數

3TP對LIU眼組織ICAM-1、IL-1β和MCP-1水平的影響

ELISA檢測結果顯示，與模型組相比，TP組虹膜睫狀體中ICAM-1、IL-1β和MCP-1水平分別降低42.78%、51.56%和48.06%，視網膜中ICAM-1、IL-1β和MCP-1水平分別降低34.58%、54.43%和45.58%，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1、2。

表1各組小鼠虹膜睫狀體中ICAM-1、IL-1β和MCP-1水平的比較

Table 1. The levels of ICAM-1， IL-1β and MCP-1 in the corpus ciliare choroideae (Mean±SD.n=6)

GroupICAM?1(μg/g)IL?1β(ng/g)MCP?1(ng/g)Control6．82±0．960．87±0．041．46±0．13LPS35．53±2．154．17±0．20218．52±10．33TP+LPS20．33±1．24?2．02±0．03??113．49±8．15??

*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

表2各組小鼠視網膜中ICAM-1、IL-1β和MCP-1水平的比較

Table 2. The levels of ICAM-1, IL-1β and MCP-1 in the retina (Mean±SD.n=6)

GroupICAM?1(μg/g)IL?1β(ng/g)MCP?1(ng/g)Control3．76±0．550．57±0．021．03±0．08LPS22．41±2．352．37±0．43151．11±9．68TP+LPS14．66±1．28?1．08±0．06??82．23±10．22??

*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

討 論

葡萄膜炎以其發病機制復雜、患病率高和治療困難成為困擾患者和眼科醫生的一種疾病。且葡萄膜炎的誘發病因較多，發病機制較復雜，且易反復發作，出現多種并發癥，并可能最終導致失明。雖然葡萄膜炎的具體發病機制仍不清楚，但其最終致盲的因素歸結于炎癥反應導致的眼內組織損傷。葡萄膜富含豐富的血管，為眼內組織提供大部分的血液，也是炎癥細胞進入眼內的重要渠道。已有研究[5]發現葡萄膜炎患者由于血-房水屏障破壞，導致炎癥細胞浸潤，血管內蛋白滲出，房水中和葡萄膜固有組織細胞表達大量的炎癥介質(IL-1β、MCP-1、MIP-1、TNF-α等)，血-房水屏障周圍的炎癥細胞暴露于細胞因子和趨化因子，從而進一步引發炎癥細胞多種自分泌和旁分泌效應，產生更多的炎癥介質，而其中很多的炎癥介質具有細胞毒性作用及致組織損傷作用，最終可導致眼內組織損傷。

LIU是比較成熟的人類急性前葡萄膜炎動物模型，具有炎癥發生速度快、病程短、操作簡單、重復性和穩定性較好、易于觀察等特點，目前已被廣泛應用。LPS通過激活Toll樣受體-4介導的先天免疫和適應性免疫，誘導產生多種炎癥細胞因子(ICAM-1、IL-1、MCP-1等)，最終引起炎癥，這可能是啟動急性前葡萄膜炎的一個重要因素[6-7]。早有研究表明，葡萄膜炎發病過程中，ICAM-1介導白細胞和炎癥部位組織細胞的識別和黏附，導致眼部組織的免疫性損傷[8]。IL-1β主要介導致炎因子IL-1的生物學作用[9]。宋芹等[10]報道雷公藤多苷可能是通過降低血清IL-1β水平而達到治療白塞氏病葡萄膜炎的作用。MCP-1能誘導并活化單核巨噬細胞，同時也調節單核細胞表面黏附分子的表達和細胞因子的產生[11]。大量的研究也表明，MCP-1在人急性葡萄膜炎時顯著升高，并與臨床癥狀的嚴重程度相關[12-13]。這都提示了細胞因子ICAM-1、IL-1β和MCP-1是誘發急性葡萄膜炎的關鍵因素。

TP是從衛矛科雷公藤中分離得到的活性最高的環氧化二萜內酯化合物，是雷公藤中的主要有效成分。TP的生理活性很強，具有明顯的抗炎、免疫抑制、抗腫瘤及抗生育等作用[14-15]。近年來研究證明，TP被廣泛用于治療對激素產生依賴性、反復發作的免疫性眼病，如葡萄膜炎、鞏膜炎、BehCet病等已取得滿意的療效[16]。目前臨床上常用的TP制劑為雷公藤多苷片、雷公藤總萜片等，但它們成分復雜，不易控制，降低了用藥的安全性，并存在口服產生的首過效應、水溶性差、生物利用度低、有效治療量小、治療窗窄等缺點[17]。因此本研究將TP制成滴眼液制劑，給予眼部局部用藥治療，在發揮其對葡萄膜炎最佳治療效果的同時減少全身給藥帶來的副作用。小鼠眼部臨床表現顯示，與模型組相比，TP組能明顯減輕LPS誘導的葡萄膜炎體征，組織病理學也表明TP組能明顯抑制虹膜睫狀體和玻璃體腔內的炎癥細胞浸潤，減輕視網膜水腫增厚，同時TP組虹膜睫狀體和視網膜中炎癥因子ICAM-1、IL-1β和MCP-1水平均明顯低于模型組，有統計學差異。本研究結果提示，TP可能通過下調炎癥因子ICAM-1、IL-1β和MCP-1表達，進而介導LPS誘導的眼部炎癥反應，最終改善葡萄膜炎。

綜上所述，0.05%TP滴眼液滲透性強，充分發揮TP的局部抗炎作用，明顯減輕葡萄膜炎的眼部組織損傷，從而為葡萄膜炎的治療提供了新的免疫療法。但TP滴眼液的開發仍存在許多難點待攻克：(1)溶解性，即選擇合適的溶劑或對TP的結構進行修飾來提高TP的溶解度；(2)抑菌，即添加合適的抑菌劑來避免使用過程中出現污染；(3)pH范圍，即調整合適的酸堿度來減少對眼部的刺激性；(4)處方和制備工藝。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Anti-inflammatory effect of triptolide on LPS-induced uveitis

SU Ying-xue, WANG Yan-dong, ZHEN Dong-qin, CAO Chen

(StateKeyLaboratoryofOphthalmology,ZhongshanOphthalmicCenter,SunYat-senUniversity,Guangzhou510060,China.E-mail: wangydsyj@163.com)

AIM: To observe the anti-inflammatory effect of triptolide (TP) on lipopolysaccharide (LPS)-induced uveitis (LIU).METHODSBALB/c mice (n=24) were randomly divided into 3 groups: blank control group (treated with normal saline), model group (treated with normal saline) and triptolide treatment group (treated with 0.05% triptolide eye drops)， with 8 mice in each group. The mice in model group and triptolide treatment group were intravitreally injected with LPS after 30 d of drug treatment. The anterior chamber was assessed by slit-lamp examination at different time points after modeling. Ocular tissues were collected for histological examination. The protein levels of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), interleukin-1β (IL-1β) and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) in iridial and retinal samples were tested by ELISA.RESULTSCompared with model group, the inflammatory reaction and clinical score were obviously decreased in triptolide treatment group at 24 h after modeling (P<0.01). The histopathological observation indicated that infiltrating inflammatory cells were dramatically reduced in the anterior and posterior segments by triptolide eye drops. In addition, the expression levels of ICAM-1, IL-1β and MCP-1 were significantly decreased in the ocular tissues by treatment with triptolide (P<0.05).CONCLUSIONTriptolide prevents the injury of LIU by down-regulating inflammatory cytokines, and may be a new immune therapy for uveitis.

Triptolide; Uveitis; Inflammatory cytokines

1000- 4718(2017)11- 2099- 05

2017- 05- 24

2017- 07- 05

國家自然科學基金資助項目(No. 81500739)；廣東省中醫藥局科研項目(No. 20151168)；廣東省醫學科學技術研究基金資助項目(No. A2015170)

△通訊作者 Tel: 020-87331543； E-mail: wangydsyj@163.com

R773.9； R285.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.029