低強度超聲聯合微泡通過提高ROS水平促進甲狀腺癌細胞自噬性死亡*

劉美快， 袁哲英， 黃凱西， 李 慧， 姜海丹， 陳 斌

(溫州醫科大學附屬第一醫院超聲科， 浙江 溫州 325000)

低強度超聲聯合微泡通過提高ROS水平促進甲狀腺癌細胞自噬性死亡*

劉美快， 袁哲英， 黃凱西， 李 慧， 姜海丹， 陳 斌△

(溫州醫科大學附屬第一醫院超聲科， 浙江 溫州 325000)

目的探討低強度超聲聯合微泡造影劑對甲狀腺癌細胞自噬性死亡的作用，并分析自噬的激活機制及其對細胞活力的影響。方法采用頻率20 kHz、功率80 mW的低強度超聲聯合微泡造影劑處理人甲狀腺癌TPC1細胞，處理細胞60、120和240 s后，采用Live/Dead 實驗和CCK-8實驗分析細胞死亡和活力；Western blot分析微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ)、自噬相關蛋白5(autophagy-related protein 5，ATG5)和SQSTM1/P62的蛋白水平變化；單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)染色、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)-LC3轉染和透射電鏡觀察細胞內自噬體的數量；2′, 7′-二氯二氫熒光素二乙酸脂(DCFDA)染色分析細胞活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的水平，用N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cys-teine，NAC)抑制氧化應激水平，分析ROS在自噬激活中的作用；ATG5 siRNA轉染抑制自噬水平并分析自噬性死亡的作用。結果低強度超聲聯合微泡顯著促進TPC1細胞死亡，抑制TPC1細胞活力(P<0.05)，并與處理時間顯著相關。相對于單純低強度超聲組和微泡組，超聲聯合微泡顯著升高LC3-Ⅱ和ATG5蛋白水平，抑制P62蛋白水平(P<0.05)。MDC染色、GFP-LC3轉染和透射電鏡觀察發現，超聲聯合微泡明顯增加TPC1細胞中自噬體的數量。超聲聯合微泡與單純低強度超聲組和微泡組相比，提高了細胞的ROS水平，而NAC顯著降低超聲聯合微泡提高的LC3-Ⅱ蛋白水平(P<0.05)。ATG5 siRNA抑制自噬并顯著增加細胞活力(P<0.05)。結論本研究說明低強度超聲聯合微泡可能通過提高甲狀腺癌細胞中的ROS水平促進細胞的自噬性死亡，從而引起甲狀腺癌細胞死亡。

甲狀腺癌； 低強度超聲； 微泡； 自噬； 活性氧簇

甲狀腺癌是最常見的內分泌系統惡性腫瘤，近來其發病率快速上升，在中國城市居民所有的惡性腫瘤中排名第十[1]。雖然手術治療和放射性碘治療對大多數的甲狀腺癌具有較好的效果，但是不同的病理類型、晚期、放射性碘耐受及復發和轉移導致其在臨床的處理上仍較為棘手[2-3]。近年來，低強度超聲(low-intensity ultrasound，LIUS)在腫瘤治療中逐漸得到應用，相對于高強度超聲通過產生高熱量來直接或者間接破壞腫瘤組織，低強度超聲主要依靠直接抑制腫瘤細胞的增殖活力、促進腫瘤細胞的死亡或提高化療藥物的抗腫瘤作用來治療腫瘤，而聯合微泡(microbubbles，MBs)往往可以促進超聲的治療效果[4]。但是在甲狀腺癌細胞中，低強度超聲聯合微泡的作用尚不明確。

既往研究顯示自噬(autophagy)是細胞在應激時的自我保護機制，但是其同樣是一種與凋亡相似的程序性死亡方式，過度的自噬會引起細胞的自噬性死亡(autophagic cell death)[5]。甲狀腺癌細胞中同樣發現存在自噬性死亡，近來發現自噬是治療甲狀腺癌的潛在靶點之一。研究報道低強度超聲聯合微泡可以促進腫瘤的凋亡[3, 6]，但是對于自噬性死亡的作用尚不清楚。本文擬將低強度超聲聯合微泡作用于人甲狀腺癌PTC1細胞，通過檢測細胞活力、自噬和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)等指標來了解低強度超聲聯合微泡對PTC1細胞自噬性死亡的作用，以及自噬的激活機制及其在促進PTC1細胞死亡中的作用。

材 料 和 方 法

1試劑

RPMI-1640培養基、胎牛血清(fetal bovine se-rum，FBS)和0.25%胰蛋白酶購自HyClone； Live/Dead試劑盒購自Invitrogen；CCK-8試劑盒購自上海東仁化學科技公司；2’, 7’-二氯二氫熒光素二乙酸脂(2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFDA)染色試劑盒和總蛋白提取試劑購自碧云天公司；抗微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associate protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ)、自噬相關蛋白5(autophagy-related protein 5,ATG5)、P62和β-actin抗體均購自CST；N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cys-teine，NAC)和單丹磺酰戊二胺(monodansylcadave-rine， MDC)熒光染料購自Sigma；綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)-LC3腺病毒購自上海漢恒生物公司。

2方法

2.1PTC1細胞的培養及分組 人甲狀腺癌TPC1細胞購自中科院上海細胞庫，置于含10% FBS的RPMI-1640培養基中 37 ℃、5% CO2濕化培養箱中培養， 2～3 d換1次培養基，每2～3 d傳代1 次。

實驗將細胞隨機分為4組：對照(control)組、單純低強度超聲(LIUS)組、單純微泡(MBs)組和低強度超聲聯合微泡(LIUS+MBs)組。上述處理后，細胞均繼續培養24 h。

根據文獻進行低強度超聲處理[3, 6]， 0.25%胰酶消化后將細胞轉移至平底的35 mm 培養皿 。在超聲探頭與培養皿管間涂有耦合劑，將探頭輻射面垂直向上放置于培養皿底部，80 mW、20 kHz低強度超聲聯合微泡造影劑，作用于細胞達60、120和240 s。當聯合微泡處理時， SonoVue超聲造影劑在DMEM培養基中稀釋成2×109MBs/L的終濃度。超聲處理后，細胞繼續培養24 h。

2.2Live/Dead 實驗檢測細胞死亡率 24孔板中每孔種植1×105個細胞培養過夜。用80 mW、20 kHz低強度超聲聯合微泡造影劑處理60、120和240 s后，更換新鮮的培養基繼續培養24 h， 吸棄培養液，PBS清洗3次。稀釋Calcein-AM成4 μmol/L，稀釋PI成6 μmol/L，加入含有Calcein-AM和PI的培養基，培養箱中繼續孵育30 min。激光共聚焦顯微鏡下選用488 nm激發波長觀察細胞的死亡率。每組重復觀察6個平行樣品。

2.3CCK-8實驗檢測細胞活力 PTC1細胞經過上述處理后，在96孔板每孔鋪5 000個細胞，培養24 h后，將處理的液體更換成100 μL新鮮的培養基，再在每個孔中加入10 μL的CCK-8反應劑，37 ℃中孵育1 h，最后在酶標儀上于450 nm波長測量并讀取吸光度(A)，所得值為相對于對照組的數值。

2.4Western blot實驗 使用含有1%苯甲基磺酰氟 (phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法來測定蛋白質濃度。將細胞總蛋白進行SDS-PAGE，然后通過濕轉的方法將蛋白轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h后，使用抗LC3-Ⅱ、P62和ATG5的抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST清洗3遍后，使用辣根過氧化物酶標記的 II 抗在常溫下孵育2 h，再使用ECL發光液在成像系統上進行曝光。蛋白質條帶的半定量分析使用AlphaEaseFC 4.0軟件進行分析。

2.5MDC 染色 MDC用來標記細胞中酸性自噬泡。PTC1細胞經處理后， 用PBS清洗3遍， 0.05 mmol/L MDC加入細胞中，37 ℃孵育30 min。PBS清洗3遍，紫外激發光倒置熒光顯微鏡下觀察細胞。為了觀察細胞的自噬率，上述染色后的細胞用流式細胞術進行檢測。

2.6GFP-LC3轉染 消化細胞后，將細胞密度調整至50%～70%，培養基液體量為2 mL。使用GFP-LC3腺病毒進行感染，MOI值為100，腺病毒滴度為1×1013/L。根據實驗操作手冊，腺病毒使用1 mL的無血清培養基進行稀釋，具體計算方式為，6孔板細胞數量為(1～2)×106，MOI值為100，病毒數量為2×108，加入的腺病毒劑量為20 μL。加入腺病毒前，將培養基換成無血清的培養基1 mL，把上述劑量的腺病毒溶解在無血清的培養基中。加入腺病毒后，在37 ℃孵育2 h，將無血清的培養基更換成正常培養基，然后將PTC1細胞轉移至培養箱孵育過夜，在熒光顯微鏡下觀察轉染效果和轉染效率。當綠色熒光的細胞數量占據大部分細胞的時候，再進行處理。處理后在玻璃培養皿中培養24 h，使用激光共聚焦顯微鏡觀察。GFP-LC3陽性細胞率在200倍下進行計數。

2.7透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察 上述低強度超聲聯合微泡處理后，在培養瓶中培養24 h，再分別使用刮刀將細胞從培養瓶上刮下來，注意避免過分損傷細胞，防止細胞破碎。將細胞離心收集轉移至EP管，加入2%戊二醛4 ℃固定過夜，PBS漂洗，使用1%鋨酸4 ℃固定2 h，醋酸鈾4 ℃染色，70%→80%→90%→100%丙酮梯度脫水，預包埋，Epon 812環氧樹脂包埋，半薄切片及甲苯胺藍染色進行細胞定位，LKB-V型超薄切片機超薄切片，透射電鏡下觀察PTC1細胞。

2.8DCFDA染色 用DCFDA染色分析細胞內ROS水平。PTC1細胞培養在玻璃底的培養皿中，細胞經過處理后，將10 μmol/L的DCFDA染液加入到細胞中， 37 ℃中孵育20 min。0.25%胰酶蛋白消化細胞，于激發光波長488 nm和發射光波長525 nm下，流式細胞儀分析熒光強度。

2.9ATG5siNRA的轉染ATG5 siRNA的設計參考文獻[19]，正義序列為5’-AAUUCGUCCAAACCACACAUCUCGA-3’，并由上海吉瑪公司合成。PTC1細胞消化后計數，在6孔板中每孔加入2×105的細胞，培養過夜。轉染使用Lipofectamine 2000進行。轉染后48 h，根據實驗設計中的處理方法進行干預。以非特異性的非靶向的siRNA作為對照RNA。轉染后，提取細胞總蛋白行Western blot檢測分析轉染的效果。

3統計學處理

使用SPSS 15軟件包進行統計分析。實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示，不同組之間的差異使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，使用SNK-q檢驗進行各組均數間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1低強度超聲聯合微泡促進PTC1細胞死亡并抑制細胞活力

本研究首先使用Live/Dead和CCK-8實驗分別分析低強度超聲聯合微泡對人甲狀腺癌PTC1細胞死亡和活力的影響。正常對照組和單純低強度超聲組中，以胞漿的綠色熒光(活細胞)為主，偶見胞核的紅色熒光(死細胞)。在低強度超聲聯合微泡組中，隨著處理時間的延長，胞核的紅色熒光逐漸增多，而胞漿的綠色熒光逐漸減少，見圖1A。Live/Dead半定量分析發現低強度超聲聯合微泡處理120 s和240 s后，細胞死亡率相對對照組顯著增加(P<0.05)，見圖1B。CCK-8實驗分析發現低強度超聲聯合微泡處理后，細胞的活力顯著下降(P<0.05)，見圖1C。

2低強度超聲聯合微泡促進PTC1細胞中自噬標志蛋白表達升高

Western blot方法進一步分析低強度超聲聯合微泡對PTC1細胞自噬水平的影響，低強度超聲聯合微泡作用PTC1細胞120 s，繼續培養24 h后，分析自噬標志蛋白LC3-Ⅱ、ATG5和P62的蛋白表達水平。單純微泡組與對照組相比，LC3-Ⅱ、ATG5和P62的蛋白水平的差異無統計學顯著性，但低強度超聲聯合微泡組相對單純低強度超聲組和對照組，LC3-Ⅱ和ATG5水平均顯著提高(P<0.05)，P62水平顯著降低(P<0.05)，見圖2。這提示低強度超聲聯合微泡在PTC1細胞中激活自噬。

Figure 1. The effect of the low-intensity ultrasound (LIUS) combined with microbubbles (MBs) on PTC1 cell death and viability. A: Live/Dead assay for PTC1 cells treated with LIUS combined with MBs for 60 s, 120 s and 240 s; B: semi-quantity analysis of cell death percentage; C: the cell viability detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1低強度超聲聯合微泡對PTC1細胞死亡和活力的影響

Figure 2. The effect of the low-intensity ultrasound (LIUS) combined with microbubbles (MBs) on autophagy-related proteins in the PTC1 cells. Mean±SD.n=6.##P<0.01vsLIUS+MBs group.

圖2低強度超聲聯合微泡對人甲狀腺癌PTC1細胞中自噬標志蛋白水平的影響

3低強度超聲聯合微泡促進PTC1細胞中自噬體的增加

為進一步證實低強度超聲聯合微泡對自噬的激活作用，用MDC染色、GFP-LC3轉染和TEM觀察細胞中酸性自噬泡和自噬體的數量。與對照組相比，低強度超聲組細胞中綠色熒光斑點明顯增加，而低強度超聲聯合微泡處理120 s后進一步促進了細胞中酸性的綠色熒光斑點數量的增加；GFP-LC3轉染細胞后，低強度超聲聯合微泡比單純超聲和微泡組顯著增加細胞中綠色的點狀LC3熒光；TEM觀察發現低強度超聲聯合微泡組中雙層膜結構的自噬體數量顯著增加，見圖3。上述3個實驗說明低強度超聲聯合微泡促進PTC1細胞中自噬體數量增加。

4PTC1細胞內ROS水平在低強度超聲聯合微泡激活自噬中的作用

DCFDA染色分析PTC1細胞內ROS水平，來探索自噬激活的機制。低強度超聲聯合微泡相對于對照組和單純超聲組，顯著增加細胞中ROS水平(P<0.01)，見圖4A。公認的氧化應激抑制劑NAC可以顯著地逆轉低強度超聲聯合微泡導致的LC3-Ⅱ蛋白質水平升高(P<0.01)，說明低強度超聲聯合微泡導致的ROS水平升高，可能是自噬激活的機制之一，見圖4B。

5低強度超聲聯合微泡引起的自噬性死亡對人甲狀腺癌PTC1細胞死亡和活力的影響

用RNAi方法沉默ATG5抑制自噬水平，進一步分析自噬在低強度超聲聯合微泡對PTC1細胞的作用。細胞轉染ATG5 siRNA 48 h后， Western blot發現與轉染control siRNA的細胞比較，ATG5表達明顯下降(P<0.05)，證實ATG5沉默的成功，見圖5A。低強度超聲聯合微泡作用120 s，相對于轉染control siRNA的細胞，Western blot發現轉染了ATG5 siRNA的細胞LC3-Ⅱ表達明顯下降，證實ATG5沉默降低了細胞中自噬水平(P<0.05)，見圖5B。Live/Dead實驗發現，自噬抑制后細胞死亡率比低強度超聲聯合微泡組明顯下降(P<0.05)，CCK-8實驗發現抑制自噬水平可以部分逆轉低強度超聲聯合微泡對細胞活力的抑制作用(P<0.05)，上述2個實驗證實低強度超聲聯合微泡引起的自噬性死亡參與了PTC1細胞的死亡或活力的下降，見圖5C、D。

Figure 3. Low-intensity ultrasound (LIUS) combined with microbubbles (MBs) increased the number of autophagosome in PTC1 cells. Mean+SD.n=6.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsLIUS group.

圖3低強度超聲聯合微泡促進人甲狀腺癌PTC1細胞自噬體的增加

討 論

通過化學、物理或生物方法抑制甲狀腺癌細胞的增殖或促進甲狀腺癌細胞的死亡被認為是治療甲狀腺癌可行方法之一[2]，尤其是耐受手術和放射性碘治療的甲狀腺癌，通過低強度超聲結合微泡抑制PTC1細胞生長或許是將來有希望的一種治療方式。

不同于高強度超聲，低強度超聲的生物學作用需要依靠機械效應和空化效應。直徑小于10 μm的微泡是常用的超聲造影劑[7]。在低強度超聲作用下，微泡發生擊破和塌陷，一方面可以導致細胞出現氧化應激, 另一方面在微泡和低強度超聲的聯合作用下引起細胞內骨架損傷和DNA鏈斷裂，最終引起腫瘤細胞的死亡，但是自噬性死亡在其引起的細胞死亡中的作用尚不清楚[3, 8]。本文首先通過Live/Dead和CCK-8實驗證實與單純的低強度超聲處理相比，長時間的低強度超聲結合微泡處理不僅促進PTC1細胞的死亡，更可以抑制細胞活力的下降。

自噬與甲狀腺癌的治療密切相關，一系列研究發現自噬與放射性碘吸收和治療的敏感性相關。Lin等[9]發現自噬的抑制可以促進PTC1細胞對放療和阿霉素治療的耐受，但是促進自噬卻可以提高PTC1細胞的化療和放療敏感性[3, 10]。通過ATG7 siRNA抑制自噬可以促使PTC1細胞對凋亡誘導的耐受[10]。因此治療甲狀腺癌患者，尤其是那些對傳統治療方法耐受的患者，激活自噬引起自噬性死亡或許是一種潛在的有效方法。

本文通過Western blot發現低強度超聲結合微泡作用下PTC1細胞中ATG5、SQSTM1/P62和LC3-Ⅱ 蛋白水平升高，證實自噬相關標志蛋白的改變；進一步通過MDC染色、GFPL-LC3轉染和TEM等方法觀察到細胞中自噬泡數量的顯著增加。LC3-Ⅱ是位于自噬體膜上的經典標志物；P62與自噬特異性降解蛋白結合而作為自噬降解過程的 “運輸者”，P62蛋白水平與自噬水平相反，反映自噬流水平和細胞中蛋白聚體的積聚程度[11]；ATG5是自噬形成過程中的關鍵蛋白，是 RNAi沉默抑制自噬激活的常用靶點[12]。本文使用ATG5 siRNA抑制低強度超聲結合微泡作用后自噬激活，卻發現PTC1細胞的死亡反而減少而細胞活力卻上升，這證實了自噬性死亡在低強度超聲結合微泡促進PTC1細胞死亡和抑制細胞活力中的作用，這與其它治療甲狀腺癌的研究結果相似[4]。

Figure 4. The involvement of ROS production in autophagy activation induced by low-intensity ultrasound (LIUS) combined with microbubbles (MBs) in PTC1 cells. A: DCFDA staining for the ROS production in the PTC1 cells; B: Western blot for determining LC3-Ⅱ level in the cells treated with LIUS combined with MBs andN-acetyl-L-cysteine (NAC). Mean±SD.n=6.##P<0.01vsLIUS+MBs group.

圖4PTC1細胞內ROS水平在低強度超聲聯合微泡激活自噬中的作用

單純低強度超聲與細胞內ROS生成的關系具有一定的爭議。研究發現1 MHz的單純低強度超聲可以抑制H2O2細胞內ROS的生成[13]；Feril等[14]發現1 MHz的低強度超聲對人白血病細胞的ROS生成沒有影響；但是低強度超聲也可以促進金絲桃素引起巨噬細胞內ROS的合成[15]。本文發現雖然單純低強度超聲對PTC1細胞內ROS水平沒有影響，但是微泡結合低強度超聲卻可以顯著促進細胞內ROS水平升高。更重要的是，ROS被認為是激活自噬的重要機制之一。芹黃素通過提高細胞內ROS水平激活甲狀腺癌細胞的自噬性死亡[16]。ROS促進自噬的具體機制分為轉錄和轉錄后調節兩方面，涉及大量的分子機制，包括ROS-FOXO3-LC3/BNIP3-autophagy信號通路、ROS-NRF2-P62-autophagy信號通路和ROS-TIGAR-autophagy信號通路等[17]，而低強度超聲結合微泡促進的ROS如何激活自噬性死亡需要進一步的研究。

綜上所述，低強度超聲結合微泡導致PTC1細胞死亡并抑制細胞增殖，促進細胞自噬性死亡和細胞內ROS合成增加。通過ROS抑制劑NAC證實ROS在自噬激活中的作用；通過ATG5沉默抑制自噬證實自噬性死亡在PTC1細胞死亡和細胞活力下降中的作用。因此低強度超聲結合微泡可能通過促進ROS合成增加來激活自噬性死亡，從而導致細胞死亡。

Figure 5. The involvement of autophagic cell death induced by low-intensity ultrasound (LIUS) combined with microbubbles (MBs) in the death and viability of the PTC1 cells. A: Western blot for determining ATG5 level in the PTC1 cells afterATG5 siRNA transfection; B: Western blot for determining LC3-Ⅱ level in the PTC1 cells afterATG5 siRNA transfection; C: the result of Live/Dead assay for the PTC1 cells after autophagic inhibition; D: the result of CCK-8 assay for detecting the cell viability after autophagic inhibition. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsLIUS+MBs group.

圖5低強度超聲聯合微泡引起的自噬性死亡對人甲狀腺癌PTC1細胞死亡和細胞活力的影響

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Low-intensity ultrasound combined with microbubbles activates auto-phagic death of thyroid cancer cells by promoting ROS production

LIU Mei-kuai, YUAN Zhe-ying, HUANG Kai-xi, LI Hui, JIANG Hai-dan, CHEN Bin

(DepartmentofUltrasound，TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:doctorchbe@126.com)

AIM: To investigate the effect of low-intensity ultrasound combined with microbubble contrast agent on autophagic death of thyroid cancer cells, and to analyze the mechanism of autophagy activation and its effect on cell viability.METHODSHuman thyroid cancer cell line TPC1 was treated with low-intensity ultrasound at 20 kHz frequency and 80 mW intensity combined with microbubbles. The cell death and viability were analyzed by Live/Dead assay and CCK-8 assay 60, 120 and 240 s after the treatment. The protein levels of microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ (LC3-Ⅱ), autophagy-related protein 5 (ATG5) and SQSTM1/P62 were determined by Western blot. The number of intracellular autophagosomes was measured by the methods of monodansylcadaverine (MDC) staining, green fluorescent protein (GFP)-LC3 transfection and transmission electron microscopy. The level of reactive oxygen species (ROS) was mea-sured and the effect of ROS on autophagy activation was evaluated byN-acetyl-L-cysteine (NAC) treatment. The effect ofATG5 siRNA transfection on autophagy was analyzed for determining the role of autophagic death.RESULTSLow-intensity ultrasound combined with microbubbles significantly promoted TPC1 cell death and inhibited TPC1 cell viability (P<0.05) in a time-dependent manner. Compared with low-intensity ultrasound group and microbubble group, ultrasound combined with microbubbles significantly increased the protein levels of LC3-Ⅱ and ATG5, but inhibited the protein level of P62 (P<0.05). The results of MDC staining, GFP-LC3 transfection and transmission electron microscopy showed that ultrasound combined with microbubbles significantly increased the number of autophagosomes in the TPC1 cells. Compared with low-intensity ultrasound group and microbubble group, ultrasound combined with microbubbles increased the level of ROS, while NAC significantly reduced the protein level of LC3-Ⅱ (P<0.05). Thansfection withATG5 siRNA inhibited the autophagy, significantly decreased the percentage of cell death and increased cell viability (P<0.05).CONCLUSIONLow-intensity ultrasound combined with microbubbles promotes the autophagic cell death by increasing the level of ROS in thyroid cancer cells, leading to death of thyroid cancer cells.

Thyroid cancer; Low-intensity ultrasound； Microbubbles; Autophagy; Reactive oxygen species

1000- 4718(2017)11- 2000- 09

2017- 05- 12

2017- 09- 01

溫州市科技計劃(No. Y20170217)

△通訊作者 Tel: 0577-88069567； E-mail: doctorchbe@126.com

R736.1; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.013