孫 云， 柳 剛， 蔣雅麗， 張 斌， 趙 璇， 李學剛

(山東大學第二醫院腎內科， 山東 濟南 250033)

紅細胞生成素抑制活性氧誘導的紅細胞衰亡*

孫 云， 柳 剛△， 蔣雅麗， 張 斌， 趙 璇， 李學剛

(山東大學第二醫院腎內科， 山東 濟南 250033)

目的觀察紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)對過氧化氫(H2O2)刺激后紅細胞衰亡(eryptosis)和紅細胞中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成的影響，并探討其可能機制。方法將1%健康人紅細胞懸液在以下3組不同的體外培養液中孵育：對照組(C組，培養基為PBS液)、H2O2組(H組，培養基為H2O2終濃度100 μmol/L的PBS液)和EPO組(E組,培養基為H2O2終濃度100 μmol/L、EPO終濃度2×104U/L的PBS液)。分別在孵育24 h和60 h時，留取紅細胞以備檢測。使用流式細胞術檢測紅細胞的衰亡率、紅細胞內ROS和紅細胞內鈣離子濃度([Ca2+]i)，觀察各檢測指標的變化并分析其相關性。結果紅細胞衰亡率在C組隨孵育時間延長而增加，在相同觀察時點，H組較C組明顯增加(P<0.01)，E組較H組明顯降低(P<0.01)。H組紅細胞的ROS 生成較C組明顯增多，[Ca2+]i較C組明顯升高(P<0.01);E組紅細胞的ROS生成較H組明顯減少，[Ca2+]i較H組明顯降低(P<0.05或P<0.01)。結論H2O2誘導健康紅細胞加速衰亡，而EPO可以抑制H2O2誘導的紅細胞衰亡，其機制可能與抗氧化及 [Ca2+]i的改變有關。

過氧化氫； 紅細胞衰亡； 紅細胞生成素； 活性氧簇； 細胞內鈣離子濃度

紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)分泌相對或絕對不足是導致慢性腎功衰竭患者發生貧血的最主要原因[1]，故EPO 的定期體內補充[2]是迄今以來治療腎性貧血的最有效和最廣泛的方法。EPO作為紅系祖細胞生成階段的刺激因子，它治療貧血的主要機理是在骨髓中血細胞分化初始階段刺激紅系祖細胞分化。近年發現，EPO這種內分泌激素還具有其它多種特性，包括促進血管增生[3]、抗氧化[4-6]和抗凋亡[7-8]等。慢性腎衰階段，尤其在進入替代治療之后，體內環境中的氧化應激狀態不僅持續存在，并且逐漸加劇，導致過氧化產物生成過多，抗氧化產物不足。尿毒癥已經成為心血管疾病的危險因素之一[9-10]。同時這種不平衡的內環境狀態對于紅細胞的生存也產生了負面影響。我們在研究EPO治療腎性貧血的過程中發現其抗氧化和抗凋亡特性能減少尿毒癥狀態下氧化應激對紅細胞的損傷。我們將通過體外實驗觀察EPO對過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)損傷的紅細胞的保護作用，并通過紅細胞內活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和細胞內鈣離子濃度(intracellular calcium ion concentration,[Ca2+]i)的變化探討其可能的機制，以期為臨床防治腎性貧血提供新的思路和途徑。

材 料 和 方 法

1材料

EPO(商品名益比奧;沈陽三生，10 000 U/支)；Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(BD)；細胞ROS試劑盒和鈣離子熒光探針Fluo-3/AM (Abcam)；0.22 μm無菌濾器(Millipore)；無菌12孔板(Greiner)。

2主要方法

2.1外周血紅細胞的體外培養 抽取健康志愿者空腹靜脈血6 mL，EDTA抗凝, 用PBS調整細胞濃度為1×109/L(即1% 的紅細胞懸液)再分別置于12孔板， 加入如下不同培養基后，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

2.2實驗設計 將新鮮配置的1% 紅細胞懸液按照不同的體外培養基分成以下3組： (1)正常對照(control，C)組：培養基為 PBS溶液；(2) H2O2(H)組：培養基為H2O2終濃度100 μmol/L的PBS溶液； (3) EPO (E)組：培養基為H2O2終濃度100 μmol/L和EPO終濃度2×104U/L的PBS溶液。

設24 h和60 h 2個觀察點，定點收集孵育中的紅細胞，離心、洗滌，至少2次。并在1 h內使用相應儀器檢測相關數據。其中E組紅細胞提前加入相應濃度的EPO孵育2 h后，以PBS洗滌，再加入EPO與其它2組同時開始孵育。每個觀察點設有3個平行對照孔，相同試驗重復3次，測得同一時點數據后，取平均值作為該時點最終值。

2.3檢測紅細胞衰亡率 紅細胞沒有細胞核，故稱其凋亡為衰亡，在早期衰亡時，仍同樣表達磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)。Annexin V是一種分子量為35 kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，可在凋亡早期結合細胞外膜暴露的PS。Annexin V不僅可作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一，且它測定的PS表達率可代表紅細胞的衰亡率。本實驗將收集到的紅細胞用PBS洗滌后，加入緩沖液和10 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應15 min。流式細胞儀選擇激發波長488 nm和發射波長530 nm，檢測熒光強度。

2.4檢測紅細胞內ROS的水平 將收集到的紅細胞中加入以PBS稀釋終濃度為10 μmol/L的二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)。37 ℃搖床孵育20 min，使探針與細胞充分結合，DCFH-DA與ROS反應后生成帶有熒光特性的二氯熒光素(DCF)。PBS洗滌細胞3次，徹底去除未進入細胞的DCFH-DA。PBS將紅細胞重懸后，流式細胞儀選擇激發波長488 nm和發射波長530 nm，檢測熒光強度。

2.5檢測紅細胞內鈣離子濃度 將紅細胞和經DMSO稀釋的終濃度為5 μmol/L的Fluo-3/AM混合，37 ℃孵育40 min 進行熒光探針裝載，隨后適當洗滌。洗滌后再孵育25 min以確保Fluo-3/AM在細胞內完全轉變成Fluo-3。流式細胞儀選擇激發波長為488 nm，發射波長為530 nm，測定相對熒光強度(X-mode)。計算熒光指數(FI)=lg(X-mode×340)，表示紅細胞內鈣離子相對含量。

3統計學處理

所有數據均用SPSS 12.0處理，所有計數資料均用均數±標準誤(mean±SEM)表示，多個組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較使用Bonferroni校正的t檢驗，兩指標間相關性分析采用Pearson法。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1健康人紅細胞在不同培養基中的衰亡率

隨著體外孵育時間延長，紅細胞衰亡率增加。加入H2O2后，即在H組，紅細胞衰亡率較C組明顯增加(P<0.01),而E組紅細胞衰亡率較H組明顯降低(P<0.01)，見圖1。

2健康人紅細胞在不同培養基中的ROS和[Ca2+]i的變化

隨著體外孵育時間延長，紅細胞ROS生成增加，[Ca2+]i升高;當加入H2O2后，二者變化更為明顯，即在H組同樣時點，紅細胞ROS生成較C組明顯增加,同時[Ca2+]i明顯升高(P<0.05);當加入EPO后，即在E組，紅細胞ROS生成較H組明顯減少，[Ca2+]i降低(P<0.05或P<0.01)，見圖2、3。

Figure 1. The results of eryptosis detected by flow cytometry. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsC group;##P<0.01vsH group.

圖1流式細胞術檢測紅細胞衰亡率

3各指標間相關性分析

以ROS為自變量，進一步分析與紅細胞衰亡率之間相關性，呈正相關;以[Ca2+]i為自變量，進一步分析與紅細胞衰亡率之間相關性，呈正相關;以ROS為自變量，進一步分析與[Ca2+]i之間相關性，呈正相關,見表1。

討 論

EPO自可人工合成以來，對于治療各種貧血發揮了巨大作用，它主要作用于紅細胞生成的第一階段，當紅系祖細胞表達EPO受體后，形成了紅系爆式集落形成單位(burst-forming unit of erythriod，BFU-E)，繼續分化成紅系集落形成單位(colony-forming unit of erythroid，CFU-E)，只有在EPO存在情況下CFU-E才可存活，并分化成幼紅細胞或前體細胞。在紅細胞產生的第二階段，前體細胞繼續分化成熟，無需EPO的參與[11]。EPO最初專門用于治療腎性貧血[12]，并且起到了有效的治療作用。隨著EPO在臨床廣泛應用，逐漸發現了其相關的一些其它生物特性，如抗氧化、促進血管增生和抗凋亡等。本研究使用H2O2刺激健康紅細胞，通過觀察紅細胞衰亡率變化證實EPO對紅細胞的保護作用，并同時觀察了紅細胞內ROS和[Ca2+]i水平的變化。

Figure 2. ROS production in the erythrocytes detected by flow cytometry. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsC group;##P<0.01vsH group.

圖2流式細胞術檢測紅細胞的ROS水平

本研究通過向培養基中加入H2O2制造氧化應激環境，是常見的氧化應激損傷細胞的體外實驗模型，有利于從細胞水平上探討相應的病理生理機制。氧化應激在腎臟疾病的進展中發揮重要作用[13]，同時也是細胞衰亡的強烈刺激劑[14]，因此抗氧化治療具有重要意義[15]。EPO具有抗氧化和抗衰亡作用，對多種細胞的保護作用已經得到了證實。本研究結果證明100 μmol/L H2O2可有效誘導紅細胞衰亡，使細胞衰亡率明顯升高。健康紅細胞體外孵育時，隨孵育時間延長衰亡發生增加。加入H2O2后，在相同觀察時點紅細胞衰亡明顯增加，提示氧化劑誘導了紅細胞加速衰亡。而EPO干預后，相同觀察時點的紅細胞衰亡率明顯降低。本實驗證實了EPO對氧化應激環境中的紅細胞發揮了抗衰亡的作用。慢性腎功衰竭終末期，尤其進入維持性血液透析治療后，體內氧化應激狀態加劇[16]，伴隨有過多的氧化產物生成。氧化產物成為紅細胞衰亡的危險因素。紅細胞衰亡具有重要的生理意義，比如直接縮短紅細胞壽命[17]、造成細胞之間黏附還可激活凝血過程[18-19]。紅細胞的衰亡同時是個可逆的過程[20]，這提示有效抑制紅細胞衰亡有利于治療腎性貧血或者減弱凝血傾向。另外，EPO在抑制H2O2對紅細胞衰亡作用的同時，也明顯阻斷紅細胞ROS的生成。這一方面提示H2O2通過活性氧升高損傷紅細胞，另一方面表明EPO對抗H2O2損傷紅細胞的保護機制可能與抗氧化作用相關。同時也證實了EPO的抗衰亡作用與其抗氧化作用相關。

Figure 3. [Ca2+]ilevels in the erythrocytes detected by flow cytometry. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsC group;#P<0.05vsH group.

圖3流式細胞術檢測紅細胞[Ca2+]i水平

表1 在不同觀察時點各指標間相關性分析

鈣是參與紅細胞重要功能調節的重要因素之一[21]。紅細胞內鈣離子濃度變化與紅細胞衰亡具有密切的關系[22]。生理狀態下，紅細胞通過鈣泵使細胞內鈣離子濃度維持在較低濃度，各種原因導致了鈣泵功能障礙，細胞內鈣離子濃度增加，細胞膜骨架結構和脂質雙分子層改變，膜脂流動性降低。即紅細胞內鈣離子濃度增加導致紅細胞膜上PS外翻，自身壽命縮短。我們的研究發現，在紅細胞衰亡增加的同時，紅細胞ROS生成增加，同時紅細胞 [Ca2+]i增加，且在不同的觀察時點紅細胞衰亡率與ROS呈正相關，與紅細胞 [Ca2+]i呈正相關。這提示紅細胞衰亡不僅與氧化應激產物之間存在直接相關，而且 [Ca2+]i的變化也是紅細胞衰亡的直接相關因素。當對含有H2O2的培養液中紅細胞進行EPO干預后，紅細胞衰亡明顯減少，并且伴隨著ROS明顯減少和 [Ca2+]i明顯降低，且各指標相互間存在著顯著的相關性。EPO在本實驗中體現了抗氧化的藥理作用。說明在治療貧血的過程中，EPO可以作為有效的氧自由基清除劑，通過減少活性氧生成，從而降低 [Ca2+]i，最終發揮了抑制紅細胞衰亡，減輕貧血的作用。

綜上所述，本研究證實了EPO通過減少紅細胞內活性氧保護紅細胞對抗氧化應激誘導的衰亡，其作用機制與降低 [Ca2+]i有關。本研究為深入闡明EPO的抗氧化作用和對紅細胞的保護作用提供了實驗依據。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Erythropoietin inhibits eryptosis induced by reactive oxygen species

SUN Yun, LIU Gang, JIANG Ya-li, ZHANG Bin, ZHAO Xuan, LI Xue-gang

(DepartmentofNephrology,TheSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250033,China.E-mail:gangliu@sdu.edu.cn)

AIM: To observe the influence of erythropoietin (EPO) on eryptosis and production of reactive oxygen species (ROS) in erythrocytes under stimulation of hydrogen peroxide (H2O2),.and to explore its related mechanism.METHODSThe erythrocyte suspension (1%) was culturedinvitroand divided into 3 groups: control group (C group, the culture medium was PBS), H2O2group (H group, the culture medium was PBS containing H2O2at final concentration of 100 μmol/L) and EPO group (E group, the culture medium was PBS containing H2O2at final concentration of 100 μmol/L and EPO at final concentration of 2×104U/L). The erythrocytes were collected at 24 h and 60 h. The eryptosis was detected by flow cytometry with Annexin V staining. The production of ROS and intracellular calcium ion concentration ([Ca2+]i) were also analyzed by flow cytometry.RESULTSThe eryptosis in C group was increased as the incubating time extended. The eryptosis in H group was higher than that in C group (P<0.01), while that in E group was lower than that in H group (P<0.01). Meanwhile, ROS production and [Ca2+]iwere higher in H group than those in C group (P<0.01)， but those were lower in E group than those in H group (P<0.05 orP<0.01).CONCLUSIONEPO inhibits eryptosis induced by H2O2and its mechanism may be related to antioxidant effect and change of [Ca2+]i.

Hydrogen peroxide; Eryptosis; Erythropoietin; Reactive oxygen species; Intracellular calcium ion concentration

1000- 4718(2017)11- 2084- 07

2017- 04- 10

2017- 06- 13

山東大學第二醫院種子基金資助項目(No. S2015010001)；山東省自然科學基金資助項目(No. ZR2014HM045)

△通訊作者 Tel: 0531-85875451； E-mail: gangliu@sdu.edu.cn

R363； R692.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.026