針刺對運動性骨骼肌損傷大鼠骨骼肌線粒體自噬的影響*

尚畫雨， 付 玉， 夏 志， 周 越， 王瑞元△

(1成都體育學院運動醫學與健康學院， 四川 成都 610041； 2井岡山大學體育學院， 江西 吉安 343009； 3北京體育大學運動人體科學學院， 北京 100084)

針刺對運動性骨骼肌損傷大鼠骨骼肌線粒體自噬的影響*

尚畫雨1,3， 付 玉1， 夏 志2， 周 越3， 王瑞元3△

(1成都體育學院運動醫學與健康學院， 四川 成都 610041；2井岡山大學體育學院， 江西 吉安 343009；3北京體育大學運動人體科學學院， 北京 100084)

目的通過觀察針刺對大負荷運動大鼠骨骼肌線粒體自噬相關蛋白表達的影響，探討針刺在運動性骨骼肌損傷修復中的作用及其機制。方法將128只成年雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為4組：空白對照(control，C；n=8)組、單純運動(exercise，E；n=40)組、單純針刺(acupuncture，A；n=40)組和運動針刺(exercise and acupuncture，EA；n=40)組。其中，E和EA組進行1次下坡跑運動，A組和EA組(運動后即刻)施加針刺處理。后3組根據干預后不同時相又分為0 h、12 h、24 h、48 h和72 h亞組(n=8)，分別于對應時點分離比目魚肌進行檢測，使用透射電子顯微鏡觀察骨骼肌線粒體超微結構變化；采用ELISA法檢測比目魚肌線粒體定量酶檸檬酸合成酶(CS)的含量變化；應用Western blot法檢測骨骼肌PTEN誘導假定激酶1(PINK1)、parkin和微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)的蛋白表達變化。結果1次大負荷運動后大鼠比目魚肌線粒體出現明顯腫脹和肌膜下積聚等超微結構異常變化，伴有大量自噬體形成；同時CS的含量明顯減少(P<0.05)；線粒體自噬蛋白PINK1、parkin和LC3均出現一過性的表達升高(P<0.05)。運動后針刺明顯改善了線粒體超微結構的異常變化，減少自噬溶酶體的出現，同時抑制CS的含量減少，下調PINK1、parkin和LC3在線粒體上的表達(P<0.05)。結論1次大負荷運動后骨骼肌線粒體結構和數量受損，通過激活PINK1/parkin途徑誘發線粒體自噬的過度發生。大負荷運動后針刺可以緩解骨骼肌線粒體的損傷，其作用機制可能是通過下調線粒體外膜蛋白PINK1表達，抑制其對下游胞漿蛋白parkin的招募，進而影響LC3與線粒體的結合以抑制線粒體自噬過度激活。

針刺； 大負荷運動； 骨骼?。?線粒體自噬； PTEN誘導假定激酶1； Parkin蛋白

骨骼肌收縮和舒張是人體運動的原動力。但長時間和(或)大負荷運動，特別是離心運動后，骨骼肌纖維會出現運動性肌肉損傷(exercise-induced muscle damage，EIMD)，進而造成延遲性肌肉酸痛(delayed onset muscle soreness，DOMS)和運動能力下降，若不及時治療，將進一步加劇運動損傷并造成慢性疼痛或損傷。因此，探尋促進大負荷運動后的骨骼肌超微結構快速恢復的干預手段，是目前運動醫學界的熱點和難點。針刺(acupuncture)療法作為中醫傳統療法之一，在治療肌肉病患和促進肌肉功能恢復方面占據重要地位。目前我們實驗室研究認為，針刺可有效抑制大負荷運動后骨骼肌膠原纖維的增生，加強損傷肌肉中膠原的降解，從而有效地促進運動后骨骼肌修復和細胞外基質重塑[1]。

近期實驗結果表明，EIMD的發生與骨骼肌細胞凋亡[2]、自噬[3]和壞死[4]有著極為密切的關系，其中細胞自噬作為關鍵的細胞降解過程，可選擇性清除受損線粒體等細胞器以延緩細胞衰老[5-6]以及抑制細胞凋亡[7]，并通過線粒體自噬作用于線粒體質量控制(mitochondrial quality control，MQC)。線粒體自噬的直接動力來自于線粒體自噬蛋白及其相關的受體蛋白，因此研究線粒體自噬蛋白及其相關受體蛋白在運動后不同時相的變化尤為必要，在進一步證明大負荷運動誘發線粒體自噬的同時也有助于探明EIMD是否與線粒體自噬的發生有關聯，從而找到預防EIMD的方法。已有文獻報道，在哺乳動物體內，除NIP3樣蛋白X(NIP3-like protein X, NIX/BNIP3L)、BCL2/腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3(BCL2/adenovirus E1B 19 kD protein-interacting protein 3, BNIP3)和線粒體外膜蛋白FUNDC1(FUN14 domain containing 1)是與低氧環境關系密切的線粒體自噬途徑外，介導骨骼肌線粒體自噬途徑的主要為PTEN誘導假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1，PINK1)/parkin通路[8-9]。然而，目前國內外鮮見對PINK1/parkin介導線粒體自噬與EIMD關系的研究。本實驗擬通過建立大負荷運動誘導的骨骼肌損傷動物模型，并在運動后即刻施加針刺干預，通過針刺骨骼肌觀察針刺能否對骨骼肌線粒體損傷起到緩解作用，并分析其作用機制，為研究針刺干預骨骼肌損傷的恢復和預防提供一定的理論依據。

材 料 和 方 法

1主要儀器與試劑

JEM-1400透射電子顯微鏡(JEOL)；酶標儀和凝膠成像系統(Bio-Rad)；兔抗PINK1、parkin多克隆抗體和鼠抗線粒體內參照細胞色素C氧化酶亞基Ⅳ(cytochrome C oxidease subunit Ⅳ, COXⅣ)單克隆抗體購自Abcam；兔抗微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；鼠抗胞漿內參照磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)單克隆抗體購自Santa Cruz； HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)和山羊抗鼠IgG(H+L)購自北京中杉金橋生物技術公司；BCA蛋白定量試劑盒和動物組織線粒體分離試劑盒均為上海碧云天生物技術研究所產品；大鼠檸檬酸合成酶(citrate synthase, CS)ELISA分析試劑盒為 USCNLIFE 產品；TEMED、Tween-20和β-巰基乙醇購自Sigma；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

2動物分組

SPF級Spraque-Dawley(SD)大鼠128只，雄性，8周齡，(221.77±7.32) g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號為SCXK(京)2012-0001。適應性喂養3 d后，隨機分為4組：空白對照(control，C；n=8)組、單純運動(exercise，E；n=40)組、單純針刺(acupuncture，A；n=40)組和運動針刺(exercise and acupuncture，EA；n=40)組。其中，E組、A組和EA組根據干預后不同時點，又分為干預后0 h(即刻)組、干預后12 h組、干預后24 h組、干預后48 h組和干預后72 h組。本實驗共分為16個組別，每組8只。

3運動干預方案

采用小動物電動跑臺進行大鼠運動干預。在正式實驗前所有運動組的實驗大鼠進行2 d適應性訓練：第1天跑臺坡度0°，16 m/min，5 min；第2天跑臺坡度0°，16 m/min，10 min。

在適應訓練后間歇休息1 d，次日開始正式實驗。本研究的運動方案參照Armstrong等[10]的離心運動模型，采取持續性下坡跑，跑臺坡度為-16°，速度為16 m/min，運動時間為90 min。

4針刺干預方案

在1次大負荷運動后即刻(0 h)對EA組大鼠進行針刺干預，同期對A組予以相同的針刺處理。固定好大鼠后對其雙后肢進行消毒，用直徑0.25 mm的針灸針[漢醫牌，津食藥監械(準)字2009第2270002號]沿大鼠小腿三頭肌的縱向，從遠端斜刺(進針角度約30°)穿過小腿三頭肌肌腹，并留針2 min[11]。

5測試指標與方法

5.1透射電鏡觀察骨骼肌線粒體超微結構的變化 根據實驗設計時點，將大鼠分批稱重后經腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，腹主動脈取血，迅速分離大鼠比目魚肌，用刀片去除兩側肌腱和結締組織，剪取約1 mm×1 mm×1 mm的小塊比目魚肌，然后放入4 ℃預冷的2.5%戊二醛固定液，隨后用0.1 mol/L PBS沖洗，再用1%鋨酸固定，用0.1 mol/L PBS再次沖洗后進行脫水(乙醇溶液梯度為50%、70%、90%和100%)，環氧樹脂(Spurr epoxy)包埋后將其縱切，制成超薄切片，待樣品干燥后置于透射電鏡下觀察其線粒體超微結構。每1張組織切片，先在低倍視野(×500～1 000)下確定觀察區域，后在高倍視野(×2 000～8 000)下觀察其超微結構，主要觀察線粒體的分布、大小、形態、嵴的結構和自噬體的形成變化等。

5.2ELISA檢測比目魚肌線粒體CS的含量 切取100 mg新鮮的比目魚肌放入離心管內稱重后，使用動物組織線粒體分離試劑盒，按照試劑盒說明書行差速離心提取骨骼肌線粒體。采用大鼠CS ELISA分析試劑盒檢測酶的含量，測試步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

5.3Western blot測定比目魚肌PINK1及線粒體parkin和LC3的蛋白含量 將稱取的比目魚肌置于研缽中；加入液氮，將組織研磨成粉末后按照1 mg組織加入10 μL裂解液的比例進行裂解，再以4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后統一調整，使上樣量保持一致。然后以4∶1比例加入5×上樣緩沖液，98 ℃煮沸5 min。取已分裝保存的樣品加樣，樣品體積每孔20 μL，蛋白濃度1.5 g/L。隨后進行SDS-PAGE，電泳后轉至PVDF膜，封閉1 h后加 I 抗(PINK1 1∶500，GAPDH 1∶1 000， parkin 1∶1 000, LC3 1∶500, COXⅣ 1∶1 000)4 ℃孵育過夜。漂洗后加 II 抗(1∶5 000)，室溫下孵育1 h后放入凝膠成像系統中拍攝保存實驗結果。使用Gel-Pro軟件分析蛋白條帶灰度值。

6統計學處理

應用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示。實驗數據采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)，對處理因素和取材時間因素的主效應以及兩者的交互作用進行分析。各組間的單獨效應統計方法使用單因素方差分析，若方差齊性，采用SNK-q法進行檢驗；若方差不具齊性，則將原始數據轉換至齊性后再進行統計；對于不能轉換至齊性的指標數據，直接采用Tamhane’s T2的統計結果進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1骨骼肌線粒體超微結構的變化

本實驗使用透射電鏡觀察了1次大負荷運動及針刺后不同時相骨骼肌線粒體超微結構的變化，結果發現：(1) C組大鼠骨骼肌線粒體均勻分布于Z線兩側，肌膜下較少；線粒體呈細長桿狀和橢圓形，大小均一，未觀察到明顯的自噬體(雙層膜結構)。(2) E組大鼠在一次大負荷運動后骨骼肌線粒體分布不均，在肌膜下大量積聚，出現大量不同成熟階段的自噬體(如圖1中白色空心箭頭所示)。其中在運動后即刻，線粒體開始變大、腫脹，大小不一；運動后12 h，線粒體腫脹、變圓，此時線粒體損傷最為嚴重；運動后24 h，Z線較為清晰，肌膜下線粒體數量減少，線粒體形態有所恢復；運動后48 h線粒體再次出現損傷表現，但線粒體損傷程度小于運動后12 h的表現；運動后72 h線粒體的形態基本恢復到正常水平。(3) EA組大鼠在運動針刺后可見自噬體與單層被膜的溶酶體融合形成自噬溶酶體(如圖1中黑色箭頭所示)。運動針刺后即刻肌膜下線粒體較多，部分線粒體變圓、腫脹，有自噬體形成；運動針刺后12 h線粒體損傷最為嚴重，其表現比單純運動后12 h較輕，肌膜下線粒體積聚減少，但此時線粒體仍較大，有自噬溶酶體形成；在運動針刺后24 h和48 h，觀察到線粒體的結構逐漸向正常結構恢復的趨勢，仍可見自噬溶酶體；運動針刺后72 h，線粒體已經恢復到正常狀態，未觀察到明顯的自噬體和自噬溶酶體，見圖1。

Figure 1. Ultrastructural and autophagic changes of mitochondria at different time points after exercise and acupuncture (transmission electron microscopy, ×2 000). White hollow arrows show autophagosomes and black arrows show autophagolysosomes.

圖1運動及針刺后不同時相線粒體超微結構與自噬體的變化

2骨骼肌線粒體CS含量的變化

實驗結果顯示：(1) A組在處理后CS含量整體上呈現先增加再減少的趨勢，各時相與C組相比差異均無統計學顯著性。(2) E組在運動后不同時相線粒體中CS含量呈現減少趨勢，各時相均低于A組相應時點，其中在12 h和24 h差異具有統計學顯著性(P<0.05)，且在運動后即刻和24 h CS含量明顯低于C組(P<0.05)。(3) EA組在處理后CS含量總體呈先減少后增多的趨勢，各時相均略高于E組相應時點，但差異不顯著，而在針刺后24 h CS含量較C組及A組均明顯減少(P<0.05)，見表1。

表1 運動及針刺后不同時相線粒體CS含量變化

*P<0.05vsC group;☆P<0.05vsA group.

3骨骼肌PINK1蛋白表達的變化

實驗結果顯示：(1) A組在處理后骨骼肌PINK1蛋白的表達圍繞C組的水平上下波動，但與C組相比差異無統計學顯著性。(2) E組在運動后不同時相骨骼肌PINK1蛋白表達總體呈現先升高后降低的趨勢，除72 h外其余時相E組蛋白表達均高于A組，其中在12 h和24 h 差異具有統計學顯著性(P<0.05)，且在運動后12 h較C組明顯升高了1.55倍(P<0.05)，此后逐漸下降，運動后72 h PINK1蛋白表達與運動后12 h和24 h相比差異具有統計學顯著性(P<0.05)。(3) EA組在處理后呈現先升高后降低的趨勢，在針刺后12 h EA組蛋白表達較C組顯著升高了73.8%，較A組升高了77.7%，且與EA 48 h組及72 h組比較差異均具有統計學顯著性(P<0.05)，見圖2。

4骨骼肌線粒體中parkin蛋白表達的變化

實驗結果顯示：(1) A組在處理后線粒體中parkin蛋白的表達呈現上升趨勢，但與C組相比差異無統計學顯著性。(2) E組在運動后不同時相骨骼肌線粒體中parkin蛋白表達整體呈先升高，然后逐漸下降的趨勢。E組各時相parkin蛋白表達較A組均有所升高，其中在運動后即刻差異具有統計學顯著性(P<0.05)，且E組在運動后即刻和24 h蛋白表達明顯高于C組(P<0.05)，此后逐漸降低，運動后72 h恢復至C組水平，此時明顯低于即刻水平(P<0.05)。(3) EA組在處理后parkin蛋白表達總體呈現先升高后降低的趨勢，其中EA組在針刺后即刻出現最高峰，此時較72 h組差異具有統計學顯著性(P<0.05)，見圖3。

5骨骼肌線粒體中LC3蛋白表達的變化

LC3經過加工成為LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ被Atg3切除22個氨基酸，變成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ特異地與自噬體膜結合，其含量與自噬體形成密切相關，被視為自噬體的“標志物”[12-13]。且LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉變被認為是檢測自噬的一個金指標。實驗結果顯示：(1) A組在處理后線粒體中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值呈現升高趨勢，但與C組相比差異無統計學顯著性。(2) E組在運動后不同時相線粒體中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值呈現升高趨勢，除24 h外其余各時相均高于A組，其中即刻、12 h和48 h較A組差異具有統計學顯著性(P<0.05)。與C組相比，E組在運動后即刻、12 h和48 h差異具有統計學顯著性(P<0.05)，比C組分別升高了1.14倍、1.76倍和82.7%，最高峰出現在運動后12 h，此時明顯高于運動后即刻水平(P<0.05)，運動后24 h和72 h則明顯低于即刻和12 h水平(P<0.05)，運動后48 h也顯著低于12 h水平(P<0.05)。(3) EA組在處理后LC3-Ⅱ/Ⅰ比值總體呈現先升高后降低的趨勢，各時相均低于E組相應時點，在12 h組差異顯著(P<0.05)，而A組在各時相的差異均無統計學顯著性。此外EA組在針刺后12 h與C組相比差異具有統計學顯著性(P<0.05)，比C組升高了71.8%，24 h出現下調，72 h蛋白表達恢復至C組水平，見圖4。

Figure 2. The protein expression of PINK1 in the skeletal muscle at different time points after exercise and acupuncture. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsC group;△P<0.05vsEA 12 h group;☆P<0.05vsA group.

圖2運動及針刺后不同時相骨骼肌PINK1蛋白表達的變化

Figure 3. The protein expression of parkin in the mitochondria at different time points after exercise and acupuncture. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsC group;△P<0.05vsEA 0 h group;☆P<0.05vsA group.

圖3運動及針刺后不同時相線粒體中Parkin蛋白表達的變化

討 論

1針刺對大負荷運動大鼠骨骼肌線粒體結構和數量的影響

針刺療法作為中醫傳統療法之一，治療骨骼肌損傷歷史悠久，療效肯定。早期研究報道了針刺機體特定的部位，可將局部刺激信號通過組織間機械力的傳導傳遞給周邊組織，并產生相應的級聯反應，引發細胞后續功能性反應[14-16]。盧鼎厚等[17]按照《靈樞》中提出的應用斜刺針法治療肌肉損傷的理論依據，摸索采用針刺方法干預骨骼肌損傷，取得了良好的治療效果。段昌平等[16]通過人體肌肉活檢發現，在大負荷運動后對肌肉進行針刺，可以抑制線粒體腫脹，使線粒體數量增多，緩解肌痙攣，從而促進肌纖維超微結構恢復，對DOMS有較好的緩解作用。張學林等[18]通過動物實驗發現，針刺干預能修復骨骼肌超微結構損傷，有效治療大負荷運動引起的骨骼肌過度使用損傷，其效應與增加線粒體數量有關。本實驗在前期研究的基礎上，提取離心運動最易損傷的慢肌(比目魚肌)進行研究，觀察斜刺比目魚肌對其線粒體結構和數量的影響，試圖從線粒體的角度來探尋針刺緩解骨骼肌損傷的作用效果及機理。首先，我們沿用盧鼎厚等[19]肌肉斜刺的針刺手法，觀察了運動針刺后比目魚肌線粒體的結構變化。結果可見，大負荷運動后比目魚肌線粒體出現明顯腫脹和肌膜下積聚等超微結構異常變化，有大量雙層膜結構的自噬體形成。然而，運動后針刺干預對運動導致的線粒體結構破壞有緩解作用，自噬體積累的情況得到明顯改善，能見到與溶酶體融合的自噬體(即自噬溶酶體)，促進了骨骼肌線粒體結構的恢復。在此基礎上，我們還檢測了針刺處理后比目魚肌線粒體定量酶[19-20]CS的含量，以觀察線粒體數量變化。結果發現，單純針刺對正常骨骼肌組織線粒體數量沒有影響。EA組總體上各時相CS含量均高于E組相應時點，其中48 h和72 h分別增多了19.2%和19.8%，提示運動后施加針刺能有效增加運動后線粒體的數量，這與段昌平[16]、張學林等[18]的研究結果一致，表明大負荷運動可導致骨骼肌線粒體受損，運動后針刺干預能通過改善骨骼肌線粒體超微結構和增加線粒體數量，從而減輕大負荷運動對骨骼肌線粒體的損害，這可能是針刺緩解骨骼肌線粒體損傷的重要原因之一。

Figure 4. The protein expression of LC3 in the mitochondria at different time points after exercise and acupuncture. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsC group;△P<0.05vs0 h group;▲P<0.05vs12 h group;☆P<0.05vsA group;■P<0.05vsE group.

圖4運動及針刺后不同時相線粒體中LC3蛋白表達的變化

2針刺對大負荷運動大鼠骨骼肌線粒體自噬蛋白的影響

目前已證實，PINK1是parkin的上游蛋白，PINK1/parkin通路介導的線粒體自噬途徑在哺乳動物細胞自噬依賴的對受損線粒體的降解過程中發揮關鍵作用[21-23]，但在運動及針刺誘導線粒體自噬中所扮演的角色仍知之甚少。Vainshtein等[24]報道，1次力竭性運動后骨骼肌線粒體融合分裂和自噬能力增強，表現為parkin和Drp1表達上調。崔迪等[25]對小鼠進行6周高脂膳食干預后，小鼠骨骼肌中線粒體自噬相關的PINK1/parkin、NIX/BNIP3信號在轉錄及翻譯水平均存在不同程度的異常，但耐力訓練可改善線粒體自噬水平，穩定線粒體功能，而且PINK1/parkin信號相對于NIX/BNIP3信號的變化在骨骼肌中更加敏感。以上說明，適度的運動訓練可在一定程度上激活自噬水平，這有利于維持骨骼肌的穩態以及介導運動適應；而當不良應激作用于機體時，引起自噬水平的過度激活可能會導致線粒體以及細胞的功能異常。此外，何方[26]報道了帕金森病模型大鼠中腦黑質部parkin、泛素(ubiquitin, Ub)及泛素激活酶1(ubiquitin-activating enzyme 1，UBE1)表達較健康大鼠顯著降低，經電針預處理或治療后parkin、Ub和UBE1表達高于模型大鼠，提示針刺防治帕金森病的機制可能與改善泛素-蛋白酶體系統功能有關。然而，有關針刺骨骼肌對線粒體自噬蛋白影響的研究目前尚未見報道，本實驗進行了一些嘗試性的探索。

本研究觀察了針刺對骨骼肌線粒體自噬蛋白PINK1和parkin的影響。首先我們發現，A組在處理后骨骼肌線粒體外膜蛋白PINK1的表達與C組相比差異不具有統計學顯著性，提示針刺對正常骨骼肌組織PINK1表達可能沒有影響。EA組在處理后PINK1蛋白表達總體上低于E組水平，在處理后0 h、12 h、24 h和48 h分別下調了50.3%、31.9%、52.6%和42.7%，提示運動后針刺干預可下調運動后PINK1蛋白的表達。結合研究中大負荷運動后施加針刺能促進骨骼肌線粒體結構恢復的結果，PINK1作為損傷線粒體的分子感受器，運動針刺后PINK1蛋白表達的變化趨勢雖與E組基本相似，但變化幅度要小很多，這也可說明針刺具有緩解運動導致的線粒體結構破壞的作用。

其次，我們還發現，A組在處理后線粒體中parkin蛋白的表達與C組相比無明顯差異，提示針刺對正常骨骼肌線粒體parkin表達可能沒有影響。EA組在處理后parkin蛋白表達總體上呈現先升高后降低的趨勢，各時相表達均低于E組相應時點，且在12 h時下降幅度最大。在整體上parkin表達升高趨勢與E組基本相似，但升高幅度比E組小，提示運動后施加針刺能下調運動后線粒體中parkin的表達。Parkin介導受損線粒體的清除(線粒體自噬)，在PINK1誘導途徑下游起作用，在針刺干預措施下，PINK1蛋白表達在處理后12 h和24 h左右起到的緩解作用最為明顯，因此，提示在大負荷運動后進行針刺下調了PINK1蛋白表達，減少了PINK1在線粒體上的累積，使得胞漿中的parkin轉移至線粒體的量也隨之減少，可能通過對線粒體自噬的調節而起到了緩解線粒體損傷的作用。

進一步，我們采用Western blot方法檢測自噬體標記物LC3在線粒體中的表達，以求證針刺骨骼肌是否對線粒體自噬具有調節作用，及針刺緩解自噬體積累的作用機制是否與改善線粒體自噬發生程度有關。結果顯示，A組在處理后線粒體中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值與C組相比差異無統計學顯著性，提示針刺對正常骨骼肌線粒體LC3表達可能沒有作用。另外，E組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值在運動后即刻、12 h和48 h顯著上調，比C組分別升高了1.14倍、1.76倍和82.7%，最高峰出現在運動后12 h，由此可看出，本研究結果與電鏡下觀察到的結果相符，表明大負荷運動可引起大鼠骨骼肌細胞內線粒體自噬體的積聚。而EA組在處理后LC3-Ⅱ/Ⅰ比值總體變化趨勢與E組相似，但相同時點和E組相比，EA組均低于E組水平，且在12 h組差異顯著，此時下調了37.7%，提示運動后針刺干預可以下調運動后線粒體中LC3的表達。結合線粒體形態結構的變化，可以看出，運動后施加針刺顯著減少了自噬體與線粒體的結合，自噬體得到了較好地清除，有自噬溶酶體的出現，我們分析，針刺可能是通過減少胞漿蛋白parkin的線粒體轉位，抑制其E3泛素酶活性，從而改善了由于運動導致的線粒體自噬過度激活狀態。然而，大負荷運動誘導胞漿parkin實現線粒體轉位及針刺介導parkin調控自噬的機制仍未明確，有待于后續研究進一步闡明。

目前，線粒體自噬在細胞死亡中的作用仍然存在爭議。據報道，線粒體自噬負責清除受損的線粒體，并將分解后的物質循環再利用[27]。然而，線粒體自噬也可誘發致死性后果。如果太多的線粒體(包括健康的線粒體)由大負荷運動誘導過度的自噬清除或者降解，致使線粒體數量顯著減少，細胞活力則不能維持，最終引發自噬性細胞死亡或凋亡。目前，線粒體自噬性死亡已被認為是細胞死亡的形式之一[28-29]，除細胞自噬性死亡而外，細胞死亡的方式還包括兩大類，即細胞凋亡和細胞壞死。過往研究中，對于EIMD機理研究主要基于以下3種死亡方式：(1)大負荷運動可能通過上調絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2的表達，促進X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)與Omi/HtrA2相互結合，進而激活caspase-9和caspase-3的活性，促使細胞凋亡的發生。這一過程已在本實驗室前期研究中證實，并推測針刺治療運動性骨骼肌線粒體損傷主要在于減弱線粒體凋亡機制[30]。(2)正常肌肉在離心運動中被過度拉伸會丟失一些肌細胞膜蛋白，從而導致骨骼肌細胞凋亡或壞死[31]。(3)第3種死亡方式，即自噬性死亡，這種細胞死亡方式往往伴有特征性雙層膜包裹的自噬體的形成，而目前國內外尚未見相關報道。本研究我們發現了一次大負荷運動引起了過度的線粒體自噬的發生，可能加重了線粒體丟失，使得線粒體供能出現障礙，這一發現是對運動致細胞自噬性死亡的這一機制的重要探索，但仍有待進一步研究驗證。

基于大負荷運動對于線粒體自噬的影響，選擇有針對性的線粒體自噬的抑制劑和其它干預方式進行保護，很可能為預防運動性骨骼肌損傷提供新的線索。本研究我們發現，大負荷運動后結合針刺有效地下調了運動后PINK1和Parkin在線粒體上的表達，最終LC3與線粒體的結合量也明顯下降，從而抑制了線粒體自噬過度激活，這可能是大負荷運動后針刺緩解線粒體損傷的又一機制。此外，值得注意的是，針刺抑制過度線粒體自噬可以恢復線粒體數量，線粒體自噬的抑制防止了線粒體異常清除并逆轉了線粒體丟失，這可能是線粒體的產能恢復正常的重要原因。今后的研究中還應尋求更為直接的證據，以探明線粒體自噬過度激活究竟是線粒體丟失的原因還是后果。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of acupuncture on mitophagy of skeletal muscle in rats with exercise-induced skeletal muscle damage

SHANG Hua-yu1，3, FU Yu1, XIA Zhi2, ZHOU Yue3, WANG Rui-yuan3

(1SchoolofSportMedicineandHealth,ChengduSportUniversity,Chengdu610041,China;2PhysicalEducationCollegeofJinggangshanUniversity,Ji’an343009,China;3SportScienceCollegeofBeijingSportUniversity,Beijing100084,China.E-mail:wangry@vip.sina.com)

AIM: The effect of acupuncture on mitophagy-related protein expression in skeletal muscle of rats after heavy-load exercise was investigated to explore the role of acupuncture in the repairment of exercise-induced skeletal muscle damage.METHODSMale adult Sprague-Dawley rats (n=128) were randomly divided into 4 groups: control (C,n=8) group, exercise (E,n=40) group, acupuncture (A,n=40) group, and exercise and acupuncture (EA,n=40) group. The rats in E group and EA group performed an eccentric exercise, and the rats in A group and EA group immediately after exercise

acupuncture treatment. The rats in the latter 3 groups were further divided into 0 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h sub-groups (n=8), and soleus muscle was collected at each time point. The transmission electron microscopy was used to observe the ultrastructural changes of the mitochondria in skeletal muscle. The content of citrate synthase (CS) was measured by ELISA. The protein expression of skeletal muscle PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1), parkin and microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) was determined by Western blot.RESULTSAfter the heavy-load exercise, the mitochondria swelled and accumulated under cell membrane. The number of mitophagosomes was increased， and the content of CS was significantly decreased (P<0.05). The expression of PINK1, parkin and LC3 was significantly elevated (P<0.05). However, the acupuncture intervention after exercise promoted the recovery of mitochondrial ultrastructure, attenuated mitophagolysosome formation, maintained CS content and down-regulated the expression of PINK1, parkin and LC3 (P<0.05).CONCLUSIONHeavy-load exercise causes the damages of mitochondrial structure and function in the skeletal muscle and activates PINK1/parkin pathway to induce excessive occurrence of mitophagy. Acupuncture intervention after exercise is able to alleviate the damage of mitochondria in the skeletal muscle through decreasing the expression of mitochondrial outer membrane protein PINK1, reducing the recruitment of downstream cytoplasmic protein parkin, thereby affecting the combination of LC3 and mitochondria to inhibit the overactivation of mitophagy.

Acupuncture; Heavy-load exercise; Skeletal muscle; Mitophagy; PTEN-induced putative kinase 1; Parkin protein

1000- 4718(2017)11- 2038- 09

2017- 05- 10

2017- 07- 10

國家自然科學基金資助項目(No. 31471133)；國家體育總局運動醫學重點實驗室資助項目(No. CX17B04)；成都體育學院校級科研項目(No. 17YJ04)；成都體育學院運動醫學與健康研究所創新課題(No. CX17C02)

△通訊作者 Tel: 010-62989582; E-mail: wangry@vip.sina.com

R873; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.019