鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ抑制劑KN-93對兔心衰模型心室肌細胞晚鈉電流的影響*

劉衍冬， 顏素娟， 閆雙冰， 董泉彬， 鄭安財， 李 凡， 裴兆輝， 李菊香△

(1南昌市第三醫院心內二科, 2南昌大學第二附屬醫院心內科， 3南昌大學醫學院， 江西 南昌 330006)

鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ抑制劑KN-93對兔心衰模型心室肌細胞晚鈉電流的影響*

劉衍冬1， 顏素娟2， 閆雙冰3， 董泉彬3， 鄭安財3， 李 凡3， 裴兆輝1， 李菊香2△

(1南昌市第三醫院心內二科,2南昌大學第二附屬醫院心內科，3南昌大學醫學院， 江西 南昌 330006)

目的探討異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)誘導兔心衰(heart failure，HF)時，兔心室肌細胞晚鈉電流(late sodium current，INaL)的變化及鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)抑制劑KN-93對INaL的影響。方法經兔耳緣靜脈注射ISO (300 μg·kg-1·d-1，連續15 d)誘導兔HF模型；1月后行心臟彩超檢查和HE染色觀察心肌形態改變來評價HF模型；Western blot分析NaV1.5、CaMKⅡδ和磷酸化CaMKⅡδ的蛋白水平；經Langendorff裝置灌注消化生理鹽水(normal saline，NS)組和HF組的兔心室肌細胞，采用全細胞膜片鉗技術記錄INaL。結果與NS組相比，HF組兔心率增加(P<0.01),心室腔增大(P<0.05),心功能明顯降低(P<0.01)；心肌細胞排列紊亂,呈空泡樣變性,細胞間質存在水腫,纖維組織增多。HF組的NaV1.5、CaMKⅡδ及磷酸化CaMKⅡδ的蛋白水平與NS組相比均明顯增加(P<0.01)。HF組的INaL與NS組相比明顯增加(P<0.01)；加入海葵毒素Ⅱ(sea anemone toxin Ⅱ，ATXⅡ)后，HF組及NS組INaL均明顯增加，且HF組比NS組增加更明顯(P<0.01)；在ATXⅡ誘導電流增加穩定后，加入KN-93，NS組及HF組中INaL均明顯減少(P<0.05)。結論CaMKⅡ抑制劑KN-93能抑制心衰增加的INaL，這一作用可能與影響CaMKⅡδ活性及CaMKⅡδ參與INaL的調控有關。

鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ； 心力衰竭； 晚鈉電流； KN-93

心力衰竭(heart failure，HF)是各種心血管病的嚴重和終末階段，成為全世界心血管病醫生所面臨的重大挑戰之一。晚鈉電流(late sodium current，INaL)是由一部分特殊的內向鈉離子通道形成的持續內向鈉電流，而這部分特殊通道具有較緩慢失活特性，它由NaV1.5所編碼，是構成動作電位平臺期的主要電流之一[1-2]。正常心肌細胞只能產生很小的INaL，但在病理狀態下(心衰、心肌缺血等)，該電流可增大至5倍及以上[3]，明顯影響動作電位時程，并通過多種機制產生心律失常。目前對INaL的電生理機制已有一定的了解，但在病理狀態下引起INaL增加的分子機制還不甚清楚。鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)是一種多功能蛋白酶，包括α、β、γ和δ 4種亞基，其中δ亞基是心肌細胞中CaMKⅡ的主要成分[4]。近年研究發現HF與CaMKⅡδ有著密切聯系，并與心律失常發生有關[5-6]。本文擬研究兔HF時心室肌細胞INaL和CaMKⅡδ蛋白的變化及CaMKⅡ抑制劑KN-93對INaL的影響,旨在揭示HF時影響INaL變化的分子機制，為臨床醫務人員防治心衰患者心律失常提供實驗室依據和新思路。

材 料 和 方 法

1動物

實驗用日本長耳白兔，體重1.7～2.0 kg，2～3月齡，購于南昌龍平兔業有限公司，許可證號為SCXK(贛)2014-0005。

2主要試劑和儀器

異丙腎上腺素(isoproterenol, ISO; 上海喬豐制藥公司)；戊巴比妥鈉和膠原酶Ⅱ(Sigma)；KN-93、海葵霉素Ⅱ(sea anemone toxin Ⅱ，ATXⅡ)和抗磷酸化CaMKⅡδ單克隆抗體(Abcam)；抗NaV1.5抗體和抗GAPDH抗體(Proteintech)；抗CaMKⅡδ多克隆抗體(GeneTex)；超敏ECL化學發光試劑(Thermo scientific);其它分析純購買于天津大茂化學試劑廠。多普勒超聲診斷儀(PHILIP)；Langendorff裝置(北京眾實迪創科技公司)；EPC10 膜片鉗系統(HEKA)；Western blot電泳儀(Bio-Rad)。

3實驗方法

3.1兔心衰模型的建立 將日本大耳白兔隨機分為HF組和生理鹽水(normal saline，NS)組，每組12只。HF組兔固定后經耳緣靜脈注射ISO (300 μg·kg-1·d-1)，注意觀察有無不良反應，連續注射15 d； NS組兔固定后經耳緣靜脈注射等體積的NS (1 mL·kg-1·d-1)，連續注射15 d。各組每次藥物注射后，觀察兔基本情況，并自由進食給水。

3.2兔心臟彩超檢查 NS組和HF組兔于開始建模1月后行心臟彩超檢查。經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉(程度淺)后，胸前備皮，仰臥于超聲診斷床上。使用多普勒超聲診斷儀，分別獲得左房前后內徑(left atrial dimension，LAD)、左室舒張末內徑(left ventricular end-diastolic dimension， LVEDD)、左室收縮末內徑(left ventricular end-systo-lic dimension，LVESD)、左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)等指標。

3.3兔心肌組織的HE染色 取兔左心室心肌組織浸沒于4%多聚甲醛溶液24 h，常規脫水、包埋、切片，行HE染色，光學顯微鏡下觀察心肌形態變化。

3.4Western blot實驗 心肌組織中加入裂解液提取總蛋白，按BCA法檢測蛋白濃度。取等量蛋白樣品，SDS-PAGE后將分離的蛋白質轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，加入按相應比例稀釋的I抗，4 ℃孵育過夜。經TBST洗膜除去過量的 I 抗，然后加入Ⅱ抗，室溫孵育2 h。然后進行曝光顯影，采用Image LabTM軟件計算曝光條帶光密度值及數據分析，以GAPDH為內參照。

3.5兔心室肌細胞的分離 兔經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后，將心臟取出懸掛于Langendorff裝置上用無鈣臺式液灌流(65 r/min)3～4 min。當灌流出來的液體變干凈，將含膠原酶Ⅱ(0.4 g/L)和BSA(1 g/L)的無鈣臺式液加到灌注系統灌注消化18 min。將消化后的心臟取下，剪下靠心尖部的左心室組織并剪碎，過濾離心保存于KB液(含2 g/L BSA)中備用。

3.6全細胞膜片鉗記錄 實驗在環境溫度為20～25 ℃下進行，取適量兔心室細胞懸液于3.5 cm平皿中，待細胞沉降貼壁后，顯微鏡下選取表面光滑、心肌橫紋清晰、無收縮活動的細胞，用全細胞膜片鉗記錄電流。用正常或加有相應藥物的細胞灌流液以2 mL/min速度進行充灌玻璃微電極正壓入水，電極入水阻抗值在4～5 ΜΩ之間。利用電動三維顯微操縱儀移動玻璃微電極至細胞表面，然后用1 mL注射器給予負壓封接心肌細胞，維持封接電阻大于1 GΩ，封接結束，然后完成電極電容補償，此時就形成全細胞的記錄模式。然后進行信號采集。

4統計學處理

統計分析采用SPSS 17.0 軟件進行。計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，同一樣本處理前后比較采用配對樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應用Bonferroni檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1建模結果

1.1建模前后心室率的比較 與NS組相比，HF組兔建模后的心室率增加明顯(P<0.01)，見表1。

1.2心臟彩超結果 心臟彩色超聲圖顯示，與NS組相比，HF組LAD和LVEDD有所增大(P<0.05)，LVESD明顯增大(P<0.01)，而LVEF和LVFS均明顯下降(P<0.01)，見圖1、表2。

表1兩組兔建模前后心率的比較

Table 1. Comparison of the heart rate between the 2 groups before and after modeling (min-1. Mean±SD.n=12)

GroupBeforemodelingAftermodelingNS225．2±9．0230．8±9．5HF223．2±11．4273．4±14．6??

**P<0.01vsNS group.

Figure 1. The results of rabbit heart echocardiography. A: NS group; B: HF group.

圖1兔心臟彩超結果

表2 兩組兔心臟彩超結果

LAD: left atrial dimension; LVEDD: left ventricular end-diastolic dimension; LVESD: left ventricular end-systolic dimension; LVEF: left ventricular ejection fraction; LVFS: left ventricular fractional shortening.*P<0.05,**P<0.01vsNS group.

1.3心肌組織HE染色的形態變化 HE染色發現，NS組心肌細胞呈長梭形,平行排列,細胞之間的界限清楚，細胞核呈橢圓形,可見心肌橫紋；HF組心肌細胞排列紊亂、無規則,心肌細胞出現空泡樣變性,細胞間質存在水腫,纖維組織增多，見圖2。

Figure 2. The morphological changes of rabbit left ventricular tissues with HE staining (scale bar=50 μm). A: NS group; B: HF group.

圖2兔左心室組織HE染色的形態變化

2兩組兔心室組織NaV1.5、CaMKⅡδ和磷酸化CaMKⅡδ的蛋白水平變化

Western blot結果顯示，與NS組相比，HF組心室肌組織NaV1.5、CaMKⅡδ和磷酸化CaMKⅡδ蛋白水平明顯增加(P<0.01)，見圖3。

Figure 3. The protein levels of NaV1.5, CaMKⅡδ and phosphorylated CaMKⅡδ (p-CaMKⅡδ) in the rabbit left ventricular tissues. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNS group.

圖3兔心室組織NaV1.5、CaMKⅡδ和磷酸化CaMKⅡδ的蛋白水平變化

3兩組兔心室肌細胞的INaL及KN-93對INaL的影響

維持鉗制電位為-80 mV，給予-10 mV、持續時程為100 ms去極化電脈沖刺激可以記錄到INaL。電流穩定后，所記錄HF組INaL(-1.70 pA/pF±0.20 pA/pF)與NS組(-0.66 pA/pF±0.14 pA/pF)相比明顯增加(P<0.01)。加入30 nmo/L ATXⅡ后，INaL均有所增加(P<0.01)，且HF組比NS組增加更明顯(P<0.01)。在ATXⅡ誘導電流增加穩定后，在兩組心室肌細胞灌流液中加入1 μmo/L KN-93，INaL會降低；NS組中經ATXⅡ誘導增加的INaL由(-1.39 pA/pF±0.29 pA/pF)減少至(-0.89 pA/pF±0.12 pA/pF)(P<0.05)；HF組中經ATXⅡ誘導增加的INaL由(-2.36 pA/pF±0.12 pA/pF)減少至(-1.93 pA/pF±0.15 pA/pF)，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4、5。

Figure 4. The recordedINaLof rabbit ventricular myocytes after drug treatments. A: NS group; B: HF group. NS group and HF group each had 6 rabbits, with 3 cells in each treatment group.

圖4兔心室肌細胞經藥物處理后記錄的INaL

Figure 5. The changes ofINaLdensity in the rabbit ventricular myocytes after drug treatments. A: NS group; B: HF group; C: NS group and HF group. Mean±SD. NS group and HF group each had 6 rabbits, with 3 cells in each treatment group.##P<0.01vscontrol group;△P<0.05vsATXⅡ group;**P<0.01vsNS group.

圖5兔心室肌細胞經藥物處理后INaL的變化

討 論

目前針對HF的治療有了很大的進展，但HF在心血管疾病中仍是主要的死亡原因。建立一種穩定的HF動物模型能為研究HF的病理生理機制、臨床預防及治療提供基礎。本實驗采用經兔耳緣靜脈注射ISO誘導兔HF模型，其機制為：ISO為β受體激動劑，可增強心肌收縮力并提高心室率，以提高心排血量；但與此同時會引起周圍血管收縮，增加心臟后負荷，再加上心室率增加，這些均使心臟耗氧量增加，然而長期應用ISO可導致心肌細胞纖維化、凋亡及變性壞死，并使心室發生重構[7]，最終發生HF[8]。

本實驗發現HF組兔心室肌組織NaV1.5、CaMKⅡδ和磷酸化CaMKⅡδ的蛋白水平明顯增加；且兔HF時由NaV1.5所介導的INaL也明顯增加，這與Valdivia等[9]的結論一致。分別在HF組和NS組心室肌細胞加入ATXⅡ誘導INaL增加穩定后，再加入CaMKⅡ抑制劑KN-93，發現INaL會明顯下降，說明抑制CaMKⅡδ能降低INaL。近期研究發現使用KN-93抑制CaMKⅡ的表達后，可有效減少HF時室性心律失常的發生[10-11]。純化的CaMKⅡ幾乎沒有活性，主要通過CaMKⅡ依賴Ca2+-CaM途徑來激活。研究發現心肌中以CaMKⅡδ為主，CaMKⅡδ參與Ca2+依賴的信號轉導通路，可以發生磷酸化來調控細胞胞質中的鈣調蛋白，進一步影響細胞內Ca2+的穩態，從而在HF及心律失常發生中起著重要的作用[5-6, 12]。HF發生時，交感神經的興奮增強，通過腎上腺素能受體的信號轉導途徑活化PKA，使肌漿網內Ca2+釋放通道的磷酸化水平升高，使經蘭尼定受體(ryanoine receptor，RyR)的Ca2+釋放增多引起細胞內Ca2+增加；另一方面，HF時，INaL成倍地增加，導致心肌細胞內Na+平衡紊亂，再通過反向型鈉-鈣交換體將Na+轉出細胞，而將Ca2+移入細胞內，導致心肌細胞內發生Ca2+超載。心肌細胞內Ca2+增加會通過Ca2+-CaM途徑來激活CaMKⅡδ，并增加CaMKⅡδ的活性。Awad等[13]研究發現，HF發生時心肌CaMKⅡδ表達增加會進一步加重HF。NaV1.5是心肌細胞中重要的通道蛋白，能介導INaL。在心臟組織中NaV1.5表達異常，會引起INaL改變。HF時，增加的INaL能減少凈復極化電流，同時流入細胞內的Na+增加產生除極，從而延長動作電位平臺期，使動作電位時程延長，容易誘發早后除極和延遲后除極[14-15]，從而產生心律失常。Hashambhoy等[16]發現在心肌細胞中激活的CaMKⅡδ能調節Na+通道，而激活的CAMKⅡδ也可使肌漿網內經RyR開放，進而導致肌漿網自發釋放Ca2+產生鈣瞬時，誘發心律失常。由此可見，KN-93通過抑制CaMKⅡδ降低INaL來減少心律失常的發生，而抑制CaMKⅡδ可能成為HF患者抗心律失常藥物研究的一個新靶點。

總之，通過本研究發現CaMKⅡ抑制劑KN-93能抑制心衰增加的INaL，這一作用可能與影響CaMKⅡδ活性及CaMKⅡδ參與INaL的調控有關。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡinhibitor KN-93 on late sodium current in rabbits model of heart failure

LIU Yan-dong1, YAN Su-juan2, YAN Shuang-bing3, DONG Quan-bin3, ZHENG An-cai3, LI Fan3, PEI Zhao-hui1, LI Ju-xiang2

(1SecondDepartmentofCardiology,TheThirdHospitalofNanchang，2DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity，3SchoolofMedicine,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:ljx912@126.com)

AIM: To investigate the change of late sodium current (INaL) and the effect of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ (CaMKⅡ) inhibitor KN-93 onINaLin the cardiomyocytes after isoproterenol-induced heart fai-lure (HF) in rabbits.METHODSThe rabbit model of HF was induced by injecting isoproterenol (300 μg·kg-1·d-1) for 15 d. One month later, all rabbits

by echocardiography and HE staining to observe the morphological changes of myocardium for evaluating the HF model. The protein expression of NaV1.5, CaMKⅡδ and phosphorylated CaMKⅡδ was determined by Western blot. The ventricular myocytes were isolated from the rabbits of normal saline (NS) group and HF group by Langendorff perfusion, and the whole-cell patch-clamp technique was used to recordINaL.RESULTSCompared with NS group, the heart rate in HF group was increased (P<0.01), the ventricular cavity was enlarged (P<0.05), and the cardiac function was decreased (P<0.01). Compared with NS group, the cardiomyocytes in HF group arranged in disorder, vacuolar degeneration and myocardial interstitial edema were observed, and fibrous tissue increased. The protein levels of NaV1.5, CaMKⅡδ and phosphorylated CaMKⅡδ in HF group were higher than those in NS group (P<0.01).INaLin HF group significantly increased compared with NS group (P<0.01). After adding sea anemone toxin Ⅱ (ATXⅡ), the density ofINaLin HF group and NS group was significantly increased, but that in HF group increased more obviously than that in NS group (P<0.01). After ATXⅡ had induced stable current, we added KN-93 into NS group and HF group, and we found that the ATXⅡ-increasedINaLin NS group and HF group was significantly decreased (P<0.05).CONCLUSIONCaMKⅡ inhibitor KN-93 inhibits the increase inINaLin HF rabbits, which may be related to the activity of CaMKⅡδ and the regulation of CaMKⅡ δ onINaL.

Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ; Heart failure; Late sodium current; KN-93

1000- 4718(2017)11- 1964- 05

2017- 04- 13

2017- 07- 04

國家自然科學基金資助項目(No. 81200132)； 江西省研究生創新專項資金資助項目(No. YC2014-S085)

△通訊作者 Tel: 13657092311; E-mail: ljx912@126.com

R541.6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.007