基于線粒體Cytb基因和D-loop區序列的高郵湖湖鱭(Coilia nasus)遺傳多樣性分析

李大命，張彤晴，關浩勇，唐晟凱，劉燕山，劉小維，潘建林

(江蘇省淡水水產研究所，江蘇省內陸水域漁業資源重點實驗室，南京 210017)

基于線粒體Cytb基因和D-loop區序列的高郵湖湖鱭(Coilianasus)遺傳多樣性分析

李大命，張彤晴，關浩勇，唐晟凱，劉燕山，劉小維，潘建林

(江蘇省淡水水產研究所，江蘇省內陸水域漁業資源重點實驗室，南京 210017)

本研究利用線粒體細胞色素b(Cytb)基因和控制區(D-loop)序列作為分子標記，調查了高郵湖湖鱭(Coilianasus)種群遺傳多樣性。結果顯示，Cytb基因和D-loop區序列堿基A+T含量均高于G+C含量，顯示堿基組成具有偏倚性。38條Cytb基因序列檢出26個變異位點，定義13個單倍型，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.716±0.078和0.002 70±0.000 57；40條D-loop區序列檢出53個變異位點，定義21個單倍型，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.906±0.034和0.006 27±0.000 99。13個Cytb基因單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.014之間，NJ系統進化樹顯示單倍型聚為1支；21個D-loop區單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.019之間，NJ系統進化樹顯示單倍型聚為2支。中性檢測結果和歧點分布圖均表明高郵湖湖鱭種群穩定，近期沒有發生種群擴張。整體來看，高郵湖湖鱭種質資源遺傳多樣性水平較高，具有高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特征。

湖鱭(Coilianasus)；遺傳多樣性；線粒體DNA；細胞色素b基因；控制區序列

刀鱭(Coilianasus)是一種具有重要經濟價值的洄游性中小型魚類，隸屬于鯡形目(Clupeiformes)鳀科(Engraulidae)鱭屬(Coilia)。近年來，由于過度捕撈、環境污染及水利工程建設等因素，刀鱭天然資源趨于枯竭，保護刀鱭資源刻不容緩[1-4]。湖鱭是刀鱭一種湖泊定居型，它沒有徊游習性，在我國淡水湖泊中廣泛分布，且占漁業資源量的比重較高，已成為漁業資源的重要組成部分[5-7]。研究顯示湖鱭和刀鱭在遺傳上沒有顯著差異，屬于同一種類[8-9]。

遺傳多樣性是生物多樣性的一個重要方面，決定了物種的進化潛能和對環境變化的適應能力。掌握物種的遺傳多樣性水平是物種保護需要了解的重要內容，可以為制定針對性的保護和管理策略提供科學依據。魚類線粒體DNA是一種閉合、環狀的雙鏈DNA分子，具有結構簡單、母系遺傳、不發生重組及進化速度快等特征，使其成為分子群體遺傳學和分子系統學研究的重要分子標記[10]。細胞色素b(Cytochrome b，Cytb) 基因的結構和功能在mtDNA的13個蛋白質編碼基因中被了解得最為清楚，且其進化速度適中[11-12]。線粒體DNA控制區(D-loop)為非編碼區，因缺乏編碼的選擇壓力而比其他線粒體基因的進化速率更快，富含系統發育信息[13]。因此，Cytb基因和D-loop區序已成為魚類種群遺傳結構與遺傳多樣性研究中常用的2個分子標記。

高郵湖是江蘇省第三大淡水湖、全國第六大淡水湖，水域面積780 km2。高郵湖具有漁業生產、工農業及生活用水、航運、旅游、泄洪行洪等多種功能[14]。高郵湖有魚類63種，湖鱭是高郵湖漁業資源的優勢種類之一。受生態環境污染、不合理漁業生產方式及涉湖、涉漁工程建設的影響，高郵湖漁業資源量顯著下降，漁業可持續發展受到嚴重威脅[15]。到目前為止，有關高郵湖魚類的遺傳學資料較少。僅有研究者調查了高郵湖日本沼蝦的遺傳多樣性[16]。已有研究者開展了我國10個湖鱭地理群體遺傳多樣性和遺傳結構的研究，其中包括太湖、洞庭湖、鄱陽湖及巢湖群體[17]。但到目前為止，尚無有關高郵湖湖鱭遺傳多樣性的研究報道。本研究采用Cytb基因和D-loop區序列作為分子標記，對高郵湖湖鱭遺傳多樣性開展研究，不僅有利于豐富高郵湖魚類的分子生物學數據，而且可以為湖鱭種質資源保護及合理利用提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 樣本收集和處理

湖鱭于2016年12月份在高郵湖用刺網捕獲，隨機取40尾湖鱭樣本，體長在10.5～24.5 cm之間，平均體長為16.2 cm；體重在3.5～31.7 g之間，平均體重為16.3 g。用無水乙醇固定，帶回實驗室置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

取湖鱭肌肉組織用于基因組DNA提取。采用Takara公司的DNA提取試劑盒提取總DNA，將DNA溶于滅菌超純水，保存于-20 ℃冰箱備用。

擴增Cytb基因序列的上游引物為L14724(5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′)，下游引物為(5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′)[18]；擴增D-loop區序列的上游引物為DF1(5′-CTAACTCCCAAAGCTAGAATTCT-3′)，下游引物為DR2為(5′-ATCTTAGCA TCTTCAGTG 3′)[2]。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR體系均為50 μL，包括2×Taq酶混合液(Taq酶1.25 U，DNTP 0.2 mmol/L，Mg2+L 1.5 mmol/L) 上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，DNA模板1 μL，滅菌超純水22 μL。PCR反應條件下如下：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，53 ℃退火(Cytb)或55 ℃退火(D-loop)50 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產物純化后送上海生工生物工程有限公司進行雙向測序，測序引物與擴增引物相同。

1.3 數據分析

采用ClustalX1.83軟件[19]對獲得的Cytb基因和D-loop區序列進行多重比較，并人工校對。采用Mega 5.1軟件[20]分析序列堿基組成和變異位點，利用Kimura雙參數(Kimura-2-parameter)模型計算單倍型之間的遺傳距離，采用鄰接法(Neighbour-joining method，NJ)構建系統進化樹。利用DnaSP 5.0軟件[21]獲得群體序列遺傳多樣性參數，包括單倍型數、單倍型多樣性(h) 、核苷酸多樣性(π) 和平均核苷酸差異數(K)。采用Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗，同時結合核苷酸不配對分布分析檢驗湖鱭種群歷史動態。

2 結果

2.1 Cytb基因和D-loop區序列堿基組成

通過序列分析，本研究獲得38條Cytb基因全序列，長度為1 141 bp，共檢出26個變異位點，其中11個簡約信息位點，15個單一信息位點，沒有插入和缺失位點。4種堿基的平均含量分別為：A(27.8%)、T(30.6%)、G(14.5%)和C(27.1%)，A+T的含量(58.4%)高于G+C的含量(41.6%)(表1)。在第2和3位點，堿基G的含量最低，表現出明顯的堿基組成偏向性。

表1 Cytb基因序列堿基組成Tab.1 Base composition of Cytb gene sequence

通過序列分析，本研究獲得40條D-loop區序列，其長度為1 214～1 290 bp，其中25條長度為1 252 bp，占比62.5%；11條長度為1 290 bp，占比27.5%；2條長度為1 328 bp，占比5%；2條長度為1 214 bp，占比5%。經比對，發現D-loop區序列有4處長度為38 bp的插入或缺失序列。4種堿基的平均含量分別為：A(33.3 %)、T(33.4%)、G (14.2%)和C(19.1%)，A+T的含量(66.7%)明顯高于G+C的含量(33.3%)，表現出明顯的堿基組成偏向性。D-loop區序列共檢出53個變異位點，其中30個簡約信息位點，23個單一信息位點。

2.2 種群遺傳多樣性參數

38條Cytb基因序列共定義13個單倍型(Hb1-Hb13)(GenBank序列號：MF589305～ MF589317)，單倍型Hb11的數量最多(20個)，占比52.6%，單倍型H2、H4～H7、H9～H10和H12～H13的數量均為1個，占比2.6%，單倍型多樣性為0.716，核苷酸多樣性為0.00216，平均核苷酸差異數為2.463(表2)。40條D-loop區序列共定義21個單倍型(Hd1-Hd21)(GenBank序列號：MF589318～ MF589338)，單倍型Hd11數量最多(11個)，占比27.5%，單倍型Hd1～Hd5、Hd9～Hd10和Hd12～Hd21的數量均為1個，占比2.5%，單倍型多樣性為0.906，核苷酸多樣性為0.006 27，平均核苷酸差異數為7.568(表2)。整體來看，高郵湖湖鱭種群遺傳多樣性呈現出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性特征。

表2 高郵湖湖鱭種群的遺傳多樣性參數Tab.2 Genetic diversity of C.nasus population in Gaoyou Lake

2.3 單倍型系統樹

基于Kimura 雙參數模型估算湖鱭單倍型之間的遺傳距離，結果顯示，Cytb基因單倍型之間的遺傳距離在0.001至0.014之間，D-loop區序列單倍型之間的遺傳距離在0.001至0.019之間。

以鳳鱭(C.mystus，GenBank登錄號為KF056322.1)為外群，采用NJ法構建單倍型系統進化樹，結果顯示，Cytb基因單倍型聚為1支(圖1)；D-loop區序列單倍型聚為2支，其中單倍型Hd7～Hd17聚為1支，單倍型Hd1～Hd6、Hd18～Hd21聚為1支(圖2)。

2.4 種群歷史動態

基于Cytb基因和D-loop區序列的中性檢驗結果(表3)表明，Cytb基因的Tajima′sD和Fu′sFs中性檢驗產生的D和Fs均為負值，其中D值統計結果顯著(P=0.026)，Fs值統計結果不顯著(P=0.088)。D-loop區的Tajima′sD和Fu′sFs中性檢驗產生的D為負值，Fs為正值，且統計結果均不顯著。另外，Cytb基因和D-loop區序列核苷酸不配對分布呈多峰類型(圖3和圖4)。綜合來看，高郵湖湖鱭種群較為穩定，近期內沒有發生擴張事件。

3 討論

遺傳多樣性即基因多樣性，是指種內不同群體間或一個群體內不同個體的遺傳變異的總和。

圖1 湖鱭Cytb基因單倍型NJ系統進化樹Fig.1 Neighbor-joining molecular dendrogram based on the sequences of Cytb gene of C.nasus in Gaoyou Lake節點處的數字為1 000次bootstrap檢驗的支持率，圖2同。

圖2 湖鱭D-loop區序列單倍型NJ系統進化樹Fig.2 Neighbor-joining molecular dendrogram based on the sequences of D-loop sequence of C.nasus in Gaoyou Lake

表3 湖鱭種群的中性檢測結果Tab.3 Neutral test of C.nasus population based on Cytb gene and D-loop sequences

圖3 高郵湖湖鱭Cytb基因序列核苷酸歧點分布圖Fig.3 Distribution of pairwise differences for Cytb gene of C.nasus in Gaoyou Lake

圖4 高郵湖湖鱭D-loop區序列核苷酸歧點分布圖Fig.4 Distribution of pairwise differences for D-loop region of C.nasus in Gaoyou Lake

它不僅是生物多樣性的重要組成部分，而且是物種多樣性和生態系統多樣性的基礎，也是生命進化和物種進化的基礎。一個物種的遺傳多樣性與其適應能力、生存能力和進化潛力等密切相關[22-23]。物種的遺傳變異越豐富，對環境變化的適應能力越強，反之，更容易受到環境變化的影響。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量物種遺傳多樣性的2個常用參數。本研究采用線粒體Cytb基因和D-loop區序列作為分子標記分析了高郵湖湖鱭的遺傳多樣性。結果顯示，基于Cytb基因的湖鱭單倍型遺傳多樣性和核苷酸多樣性分別為0.716和0.002 70，基于D-loop區的湖鱭單倍型遺傳多樣性和核苷酸多樣性分別為0.906和0.006 27，顯示出較高的遺傳多樣性。與基于Cytb基因序列相比，基于D-loop區序列湖鱭種群的遺傳多樣性相對較高，這是因為魚類線粒體D-loop區序列受的選擇壓力較小、進化速率快，而Cytb基因作為線粒體編碼基因，其進化速度相對較慢[10]。已有文獻報道了基于Cytb基因的洞庭湖(h:0.643 3，π:0.002 6)、鄱陽湖(h:0.950 0，π:0.003 4)、太湖(h:0.857 0，π:0.002 1)和巢湖(h:0.901 5，π:0.002)湖鱭的遺傳多樣性水平[17]。可以得出，高郵湖湖鱭種群的遺傳多樣性水平高于洞庭湖湖鱭種群，而低于鄱陽湖、太湖和巢湖湖鱭種群。因此，高郵湖湖鱭種群的遺傳多樣性可以進一步提高。與湖鱭相比較，基于Cytb基因的刀鱭遺傳多樣性高于湖鱭[11]。同樣，基于D-loop區序列的湖鱭遺傳多樣性也低于刀鱭[2-4]。這是因為湖鱭是刀鱭的陸封型群體[9]，由奠基者效應(Founder effect)等因素的影響，其遺傳多樣性水平應低于刀鱭[11]。

整體來看，基于Cytb基因和D-loop區序列高郵湖湖鱭遺傳多樣性呈現出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特征。有研究者根據單倍型多樣性和核苷酸多樣性標準，將魚類進化情景分為4種類型(低h(<0.5)和低π(<0.005)；高h和低π；低h和高π；低h和低π)[24]。可以看出，高郵湖湖鱭遺傳多樣性屬于第2種類型。已有文獻報道了湖鱭多個地理種群的遺傳多樣性水平，均具備這一特征[17]。湖鱭種群的遺傳多樣性現狀可能是由一個較小的有效種群經歷瓶頸效應或建群效應(bottlenecks or founder events)后迅速增長，盡管變異導致單倍型的多態性的積累，但核苷酸序列的多樣化還未能積累造成[24-25]。另外，湖鱭是刀鱭的湖泊定居生態類型，種群進化時間較短，尚未有效積累更多的遺傳變異。從種群歷史動態來看，高郵湖湖鱭種群相對穩定，近期沒有發生種群擴張。

基于Kimura雙參數模型Cytb基因單倍型之間的遺傳距離在0.001至0.014之間，D-loop區單倍型之間的遺傳距離在0.001至0.019之間。整體來看，單倍型之間的遺傳距離較小，說明高郵湖湖鱭個體之間的基因交流不受限制。這是因為湖鱭運動能力較強，個體間基因交流不存在地理隔離限制。從單倍型組成來看，13個Cytb基因單倍型中優勢單倍型Hb11有20個，占比52.6%；而9個單倍型(H2、H4～H7、H9～H10和H12～H13)的數量只有1個，均占比2.6%。21個D-loop區單倍型中優勢單倍型Hd11有11個，占比27.5%；而17個單倍型(Hd1～Hd5、Hd9～Hd10和Hd12～Hd21)的數量只有1個，均占比2.5%。由此可以看出，湖鱭單倍型組成具有不均勻性。一方面優勢單倍型的個體適應能力強擁有更大的繁殖群體，而低頻率的單倍型則因環境適應能力差則擁有的繁殖群體較小，更容易對整個種群的遺傳多樣性造成不利影響。因此，需要持續加強對湖鱭種質資源保護力度，通過控制捕撈強度、改善水體生態環境以及加強資源動態變化監測等措施增加湖鱭資源量，提高其遺傳多樣性水平，改善種群遺傳結構，從而有利于湖鱭資源的可持續發展。

致謝：感謝江蘇省高寶-邵伯湖漁業管理委員會的許飛、王華和袁輝等對采樣工作的幫助與支持。

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ThegeneticdiveristyofCoilianasuspopulationinGaoyouLakerevealedbymtDNACytbgeneandD-loopsequences

LI Da-ming，ZHANG Tong-qing，GUAN Hao-yong，TANG Sheng-kai，LIU Yan-shan，LIU Xiao-wei，PAN Jian-lin

(FreshwaterFisheriesResearchInstituteofJiangsuProvince；KeyLaboratoryofFisheriesResourcesinInlandWaterofJiangsuProvince，Nanjing210017，China)

Coilianasusis an important commercial fisheries species.In recent decades，the natural resource ofC.nasushas dramatically declined due to multiple factors.In the present study，the genetic diveristy ofC.nasuspopulation in Lake Gaoyou was investigated based on mitochondrial DNA cytochrome b (Cytb) gene and control region (D-loop) sequences.The content of A+T base pairs was higher than that of the C+G base pairs in bothCytbgene andD-loopsequences，which indicating that the base composition is biased.26 variable sites were detected and 13 haplotypes were defined in 38Cytbgene sequences.The haplotype diversity and nucleotide diversity were 0.716 ±0.078 and 0.002 70±0.000 57.53 variable sites were detected and 21 haplotypes were defined in 40D-loopsequences.The haplotype diversity and nucleotide diversity were 0.906±0.034 and 0.006 27±0.000 99.The genetic distance among 13Cytbgene haplotypes varied from 0.001 to 0.014，and all haplotypes clusted one clade in the NJ phylogentic tree.The genetic distance among 21D-loophaplotypes varied from 0.001 to 0.019，and all haplotypes clusted two clades in the NJ phylogentic tree.Neutrality tests and mismatch distribution both indicated that it was stable forC.nasuspopulation in Lake Gaoyou in recent period.As a whole，the genetic diversity ofC.nasusin the Lake Gaoyou is relatively high，and it has the characteristics of high haplotype diversity and low nucleotide diversity.

Coilianasus；geneitc diversity；mitochondrial DNA；Cytbgene；D-loop

2017-07-03；

2017-08-17

江蘇省海洋與漁業資源環保項目“江蘇省水生生物資源重大專項(ZYHB16-3)”

李大命(1981- )，男，博士，副研究員，研究方向為漁業資源與環境。E-mail:ldm8212@126.com

潘建林。E-mail:Jianlinpan2006@126.com

S917.4

A

1000-6907-(2017)06-0003-06