副豬嗜血桿菌病診斷與耐藥分析

霍元楠，蔣增海*，，王宇坤，謝倩倩，張彥兵

(1．河南牧業經濟學院，動物醫學院，河南 鄭州 450046；2．河南省豬病防控工程技術研究中心，河南 鄭州 450046）

副豬嗜血桿菌病診斷與耐藥分析

霍元楠1，2，蔣增海*，1，2，王宇坤1，2，謝倩倩1，2，張彥兵1，2

(1．河南牧業經濟學院，動物醫學院，河南 鄭州 450046；2．河南省豬病防控工程技術研究中心，河南 鄭州 450046）

2017年3月，河南省清豐縣某豬場育肥豬發生咳嗽、腹式呼吸、體溫升高等癥狀，為確診病因，采集典型病豬的肺、心血，分離出一種細菌，通過染色鏡檢、氧化酶觸酶試驗和PCR分子鑒定，最終確定出分離菌為副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)，編號為qff01。選擇14種藥物，采用紙片擴散法，對已確定為副豬嗜血桿菌的分離菌株進行藥敏試驗，其結果表明分離菌株對頭孢噻呋鈉、阿莫西林-克拉維酸、恩諾沙星、頭孢曲松、阿奇霉素等藥物敏感，對氨芐西林、四環素、氯霉素、土霉素、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶耐藥。本研究結果對該豬場的副豬嗜血桿菌病防治工作提供了一定的參考依據。

副豬嗜血桿菌；分離鑒定；藥敏試驗

副豬嗜血桿菌屬于巴斯德菌科嗜血桿菌屬，是引起豬的格拉澤氏病(Glasser's Disease)的病原菌[1]，可以引起豬的多發性漿膜炎、關節炎和腦膜炎，給養豬業造成巨大的經濟損失。根據豬健康狀況和菌株毒力的高低，副豬嗜血桿菌，可以造成急性或者慢性的感染，尤其對早期斷奶仔豬造成較大的危害。隨著我國豬場的規模化和集約化進程的加快，副豬嗜血桿菌病已成為當前的流行趨勢，很多地區都有對該病的報道[2]。

2016年3月，河南省清豐縣某豬場，飼養基礎母豬150頭，存欄3月齡育肥豬約1 000頭，自從2月1日發生嚴重流感以后，多數圈舍的豬已恢復，還剩下少數圈舍豬還未康復，表現為嚴重的腹式呼吸，呼吸頻率加快，咳嗽，體溫升高到40.5～41 ℃，采食稍有減少，體況正常，皮膚發白；剖檢病變為心包積液（圖1），肺實質性變硬，氣腫，肺臟肉變、胰腺樣變（圖2），表面散在出血點，氣管內存在有大量泡沫性黏液，肺臟與胸膜黏結，腸系膜淋巴結腫大，肝臟膽汁充盈。用藥情況，強力霉素肌注給藥，氟苯尼考加替米考星拌料，一直不見好轉。為了診斷與控制該病，選取典型病例，進行了副豬嗜血桿菌分離、鑒定及藥敏試驗，現報告如下。

圖1 剪開心包膜，出現明顯的心包積液現象

圖2 肺表面散在出血點，實質性變硬，出現肉變、胰腺樣變

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基

胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)，胰酪胨大豆肉湯（TSB)購自BD公司，配制時，加入終濃度為5%的新生牛血清（購自杭州天杭生物技術股份有限公司），同時加入終濃度為10μg/mL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)量（購自Roche公司，使用前需過濾除菌）；5%鮮血瓊脂平板購自于江門市凱林貿易有限公司。

1.1.2 藥敏片

頭孢噻呋，頭孢曲松，氨芐西林，頭孢他啶，阿莫西林-克拉維酸，氨曲南，四環素，土霉素，恩諾沙星，環丙沙星，氯霉素，磺胺甲惡唑/甲氧芐啶，阿奇霉素，克林霉素，均購自oxoid公司。

1.1.3 PCR材料

瓊脂糖（Low EEO MμLti-purpose Agarose）購自HydraGene公司；2×Taq PCR Master mix緩沖液購自Genview公 司；DL2000 DNA Marker由Taksps公司提供；參考文獻[3]根據副豬嗜血桿菌16SRNA序列設計引物，PCR擴增預片段為822 bp大小；上游引物：5'-GGCTTTCGTCACCCTCTGT-3'；下游 引 物 ：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'。

1.1.4 其他試劑

快速革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術有限公司；金黃色葡萄球菌由河南牧業經濟學院預防獸醫傳染病實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 分離培養

無菌采集患豬肺部組織、心血，分別接種于已添加NAD和犢牛血清的TSA培養基，37 ℃培養24～48 h，觀察其生長情況，挑取疑似副豬嗜血桿菌單個菌落，進一步純化2～3代。

1.2.2 涂片鏡檢

從TSA平板上，挑取上述可疑單菌落，均勻涂抹于潔凈的載玻片上，自然干燥，火焰固定后，進行革蘭氏染色，油鏡下觀察形態。

1.2.3 衛星生長現象

挑取可疑單個菌落，水平劃線接種于鮮血瓊脂平板上，再在該平板上垂直劃線接種金黃色葡萄球菌落，37 ℃培養24～48 h，觀察是否有衛星生長現象和溶血現象。

1.2.4 接觸酶反應

挑取疑似HPS菌落加入到6%H2O2，觀察是否有氣泡產生。

1.2.5 PCR鑒定

挑取純培養的兩個單菌落洗脫于含200μL無菌去離子水中，渦旋均勻后，煮沸10 min立即放入-20 ℃冰箱凍融10 min，12 000 r/min離心3 min，取上清液作DNA模板。反應體 系 ：PCR Master Mix 12.5μL， 上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，滅菌的雙蒸水9.5μL，模板2μL。反應程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性50 s，59 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 1 min，30個循環，72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖進行凝膠1×TAE緩沖液中電泳。

1.2.6 藥敏試驗

挑取TSA平板上純化培養物，接種于含有NAD的胰蛋白大豆肉湯（TSB）中，37 ℃培養24～48 h。用TSB肉湯稀釋菌懸液至0.5麥氏度，用滅菌棉簽蘸取菌液，均勻涂抹于TSA培養基，用無菌的鑷子夾取藥敏片平貼于培養基表面，在37 ℃恒溫箱培養24 h，測定抑菌圈直徑。

2 結果

2.1 分離、培養

采集肺臟組織、心血接種于TSA平板，37 ℃恒溫培養24～48 h，生長為大小0.5～2 mm、無色、透明、濕潤、光滑的圓形菌落，進一步純化2～3代后，菌落形態未見改變（圖3），與已報道的文章[4]形態一致。

圖3 分離菌在TSA上生長，出現針尖樣大小，濕潤光滑透明

2.2 涂片鏡檢

將可疑菌落，涂片，染色、鏡檢，可見細菌為革蘭氏陰性，菌體表現多形態，細小桿菌，短桿菌，稍微彎曲，長絲狀，或者以單個散在纖細桿狀者居多（圖4）。

圖4 分離菌在油鏡下觀察，可見細菌為革蘭氏陰性，出現細小桿菌，短桿菌，稍微彎曲，長絲狀，或者以單個散在等多種形態

2.3 觸酶反應結果

挑取疑似HPS菌落加入到6 %H2O2，立即產生大量氣泡。

2.4 衛星生長現象

在血瓊脂平板上出現明顯的衛星現象，離葡萄球菌菌苔越近其菌長勢越好，菌落越大，可見許多圓形，針尖大小，邊緣整齊的菌落。遠離葡萄球菌菌苔越遠，菌落則越少、越小，甚至無菌落生長（圖5）。推斷出葡萄球菌周圍有利于副豬嗜血桿菌的生長［5］。

圖5 衛星現象，三條粗實線為接種的金黃色葡萄球菌，可見離葡萄球菌越近，分離菌長得越好，越遠則只有少量菌落生長，甚至無菌落生長

2.5 PCR鑒定結果

PCR產物在凝膠電泳成像儀中可觀察到約822 bp的DNA片段，以DL2000Marker為標準。可見待測樣品與預期片段大小相符合（圖6）。

圖6 分離菌PCR結果

表1 藥敏試驗結果

2.6 藥敏試驗結果

由于副豬嗜血桿菌目前還沒有判斷標準，本試驗根據參考文獻[6]中，流感嗜血桿菌藥物判定標準，進行判定。藥敏試驗結果表明本株副豬嗜血桿菌對頭孢噻呋鈉、阿莫西林-克拉維酸、恩諾沙星、環丙沙星等獸用藥敏感；同時對頭孢曲松、阿奇霉、氨曲南、頭孢他啶、克林霉素等人用藥均敏感；但是對氨芐西林、四環素、氯霉素、土霉素、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶耐藥（見表1）。

3 分析與討論

根據本病流行特點、臨床癥狀、病理變化和細菌分離與鑒定結果，將本次病例確診為副豬嗜血桿菌病。由于副豬嗜血桿菌十分嬌嫩，對環境和營養要求苛刻，臨床病料分離HPS有一定的難度，進行細菌分離時，常需要新鮮病料，適宜的培養條件和富含營養的培養基，才能提高其臨床分離率，本試驗在TSA、TSB培養基中，添加了犢牛血清、NAD，適合于副豬嗜血桿菌分離、培養。

目前該病的防治措施主要包括預防接種、藥物防治和加強飼養管理。疫苗免疫接種是預防副豬嗜血桿菌的有效方法之一。然而其血清型復雜，目前已知有15個血清型，但國內各地流行的血清型不盡相同［7］，且各型之間缺乏交叉保護，因此，臨床上一般使用藥物來防控該病。根據本次藥敏試驗結果，建議使用阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻呋或者恩諾沙星對該豬場病例進行治療，根據養殖戶反饋，治療效果較好。

藥敏試驗結果表明，副豬嗜血桿菌分離株對獸醫臨床上常用藥物：氨芐西林、四環素、土霉素、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶均耐藥，雖然氯霉素是動物禁用藥物，但是對該藥物仍然耐藥，估計與同類藥物氟苯尼考長期在豬場使用有關，進一步解釋了養殖戶使用氟苯尼考等藥物控制不住疫情的原因。

因此，在日常管理中，合理使用抗生素，減少其耐藥的產生，保持良好的飼養管理，加強通風，免疫接種當地流行毒株，搞好環境衛生，避免混合感染，實行全進全出的策略，可以減少該病發生的概率。

[1] OLIVEIRA S，PIJOAN C.Haemophilus parasuis：new trends on diagnosis，epidemiology and control[J].Veterinary Microbiology，2004，99(1)：1-12.

[2] 蔡旭旺，劉正飛，陳煥春，等.副豬嗜血桿菌的分離培養和血清型鑒定[J].華中農業大學學報 ，2005，24(1)：55-58.

[3] OLIVEIRA S，GALINA L，PIJOAN C.Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2001，13(6)：495-501.

[4] 陸國林，何海健.浙江省副豬嗜血桿菌的分離鑒定與藥敏試驗[J].中國獸醫科學 ，2010，40(6)：622-625.

[5] 薛國聰，徐成剛，涂玉蓉，等.副豬嗜血桿菌的分離鑒定與藥敏試驗[J].中國畜牧獸醫 ，2010，37(1)：134-137.

[6] 孫長貴.2013年CLSI+M100-S23文件中文版[J].中華檢驗醫學雜志，2013（1）：96-99.

[7] 周斌，儲岳峰，李超，等.華東地區副豬嗜血桿菌的分離、血清型鑒定與藥敏分析 [J]. 畜牧與獸醫 ，2009，41(11)：84-86.

河南牧業經濟學院預防獸醫學重點學科建設項目（項目編號：MXK2016102）；

霍元楠（1994-），女，河南信陽人，本科，主要從事豬病臨床診斷與防治研究；

蔣增海（1976-），男，四川簡陽人，講師，E-mail:50242328@qq.com。

2017-07-11)