規模化豬場暴發塞內加谷病及SVV HN16株的分離鑒定

賀東生，羅天霞，蘇丹萍，徐帥飛，熊景峰

(華南農業大學 獸醫學院，廣東 廣州 510642）

規模化豬場暴發塞內加谷病及SVV HN16株的分離鑒定

賀東生，羅天霞，蘇丹萍，徐帥飛，熊景峰

(華南農業大學 獸醫學院，廣東 廣州 510642）

2016年3月，華南某豬場發生水皰性疾病。經實驗室PCR診斷，排除FMDV后顯示為SVV陽性。使用PK-15細胞進行病毒培養和傳代，采用特異性的VP1基因引物擴增該片段，使用DNAMAN7．0和MEGA6．06軟件進行同源性分析。結果表明，該病毒可以在細胞上成功繁殖，成功克隆了該病毒的VP1基因，序列長度為694 bp，并進行基因測序和遺傳進化分析。序列同源性分析顯示：該毒株與國內其他毒株親緣關系較遠，單獨形成一個分支。表明該毒株為塞內加谷病毒的新成員，命名為SVV HN16。

豬；塞內加谷病毒；分離鑒定；序列分析

塞內加谷病毒（Seneca Valley virus，SVV)又名塞內加A病毒（Senecavirus A，SVA），為單股正鏈不分節的RNA病毒，隸屬小RNA毒科Senecavirus病毒屬。癥狀與口蹄疫相似，其主要通過感染仔豬使其豬鼻鏡及蹄冠處出現水皰、潰爛創面從而導致跛足甚至死亡。該病毒最早于1998年被分離[1]到，因其在2014年巴西大規模暴發才被養豬業所重視[2]。2015年3月，該病首次在我國廣東某豬場暴發，并從發病病料分離到了SVV[3]。2016年3月華南某集約化豬場肉豬和母豬群暴發水泡性疾病，發病率100%、病死率約40%。發病豬的病料經多項技術和實驗排除了FMDV、SVD等類似病原存在，證實這是一起單純SVV引起的暴發，并對該病毒進行細胞培養和分離鑒定，為該病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與細胞系

本研究從華南某豬場（2 500頭基礎母豬）3～7日齡的乳豬中，采集鼻吻、蹄冠部位出現水皰樣病變的仔豬內臟及水皰液，按1∶3加入PBS緩沖液進行稀釋研磨，6 000 g， 4 ℃離心5 min，取上清，于-80 ℃冰箱儲存備用。PK-15傳代細胞系由華南農業大學獸醫學院傳染病教研室保存。

1.2 主要試劑

One-step RT-PCR試 劑 盒、DNA Marker、dNTP、 Taq 酶 等 購自寶生物工程（大連）有限公司，pMD18-T載 體、DH5α 感 受 態 細胞、Trizol試劑、質粒提取試劑盒購自Omega公司，DNA產物純化試劑盒購自天根生化科技有限公司，CO2培養箱、DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清購自賽默飛世爾儀器有限公司，倒置顯微鏡為徠卡儀器有限公司，其他所用化學試劑都為分析純。引物合成、DNA測序由北京睿博興科生物技術有限公司完成。

1.3 引物設計與合成

本實驗室根據GenBank 所發布的序列號，選擇全基因序列，運用Primer Premier5.0針對SVV、FMDV（O、A、Asia1通用檢測型）分別設計引物，擴增片段分別為700 bp和350 bp，退火溫度分別為58 ℃和54 ℃。引物由睿博興科生物技術有限公司合成。

1.4 總RNA 的提取

將病料離心后取出上清，按Trizol法提取病毒總RNA，然后用無RNA酶的去離子水溶解，-80 ℃冰箱保存。具體步驟參照Trizol試劑說明書。

1.5 病毒的RT-PCR 檢測

以病毒總RNA為模板進行RTPCR 擴增，反應體系為：Onestep RT-PCR buffer 12.5μL， 上 下游引物各 1.0μL，RNA 模板 3μL，Rnase Free DH2O7.5μL。PCR 擴 增程序為：50 ℃ 30 min ；95 ℃預變性5 min ；95 ℃變性 30 s；54 ℃退火 3 s；72 ℃延伸 30 s，30個循環 ；72 ℃延伸 10 min ；4 ℃保存。取 5μL PCR 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，CLINX凝膠成像系統拍照觀察。

1.6 病毒的分離

取離心后保存的上清液用0.22μm無菌過濾器過濾除菌，取適量過濾后的病毒液加入到鋪滿單層細胞的細胞板上。37 ℃溫箱孵育60 min，再加入2%血清培養的DMEM37 ℃，培養48 h后收毒。在下一次傳代前，先將細胞培養物反復凍融3次，取上清液接種細胞進行傳代，在倒置顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)并記錄。

1.7 克隆測序

將陽性PCR 產物經純化回收后與PMD-18T 載體連接，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，培養后挑單個菌落進行PCR鑒定，鑒定成功的重組質粒送往睿博興科生物技術有限公司進行測序。

1.8 序列分析

將RT-PCR 擴增獲得的基因片段進行克隆、測序，利用DNAMAN7.0和MEGA6.06軟件處理，與GenBank上已公布的SVV毒株的全基因序列進行同源性比對分析，并繪制系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 病料RT-PCR 檢測結果

以提取的總RNA為模板，用SVV和FMDV引物分別對樣品進行以上2種病毒的檢測。結果如圖1所示，FMDV檢測結果為陰性，SVV 在700 bp左右有明顯條帶，檢測結果為陽性。由此說明該病毒為SVV而非FMDV。將SVV VP1基因PCR產物純化后構建至pMD-18T質粒并進行測序。

2.2 SVV CH_GDHS_2017的分離

病毒接種單層PK-15細胞，24 h時開始出現病變，48 h收毒。隨著傳代次數的增加，出現CPE的時間縮短且程度隨之加劇。目前病毒已傳至第8代，基本能在該細胞系上穩定增殖。病毒傳至24 h時有細胞變圓，折光性變強，有較多漂浮的死細胞；而對照細胞生長良好(圖2A，2B)。培養48h，細胞CPE達75%以上，細胞基本變圓且有大量漂浮的死細胞；對照仍是致密的單層細胞，只有少量的細胞漂浮在液面（圖2C，2D）。每隔2代進行PCR檢測，結果均為陽性。由此，可以確定成功分離了一株SVV HN16毒株。

2.3 SVV VP1基因同源性分析

將測序結果在NCBI中進行BLAST，結果顯示其與GeneBank中已發表序列同源性高達99%，由此進一步確定其為SVV，將其命名為SVV HN16。以GenBank中已發表的13株SVV毒株為參考（表1），進行SVV VP1基因同源性分析（圖3）。結果顯示， SVV HN16 VP1基因之間核苷酸序列同源性為85%～96.9%：其中與中國已公布毒株相比核苷酸同源性為94.7%～95.1%；與巴西毒株相比核苷酸同源性為93.9%～96.9；與美國毒株核苷酸同源性為85.0%～86.5%.巴西毒株與國內毒株相比，同源性為95.9%～97.2%。該毒株與巴西毒株同源性最高，為96.9%，與美國毒株同源性最低，為85.0%。

圖1 SVV VP1基因PCR擴增結果

圖2 A為接毒24 h；B為對照24 h；C為接毒48 h；D 為對照 48 h

表1 GenBank已登錄的svv參考毒株

圖3 基于SVV VP1基因的序列同源性

圖4 基于SVV VP1基因的遺傳進化樹

2.4 基于SVV VP1基因的遺傳進化分析

以表1中13株毒株為參考，運用MEGA6.06軟件采用Neighbor-Joining聚類分析方法構建基于VP1基因序列的進化樹。如圖4所示，SVV HN16與國內毒株親緣關系較近，而與美國毒株較遠。本次鑒定毒株與國內其他毒株雖然親緣關系較近，但單獨形成一個分支，說明該病毒是SVV新成員。

3 討論

SVV 最初分離自細胞培養基，懷疑有可能來自豬胰蛋白酶或胎牛血清[1]。在2007年，SVV在美國和加拿大的豬群中被分離[4]到，在美國和巴西等地，該病毒僅有零星報道，直至2014年11月到2015年4月，巴西出現幾次嚴重的感染癥狀，并導致巨大經濟損失，該病才逐漸被重視[5]。在2015年9月，該病在美國某豬場暴發，并伴隨大量新生仔豬死亡[6]。在2016年，國內首株塞內加谷病毒被報道[3]， 該病開始傳入我國并威脅著我國的養豬業。

本次鑒定出的SVV HN16與國內其他毒株不在一個分支，表明在進化過程中變異迅速，這種變異對疾病的防治和疫苗的研究增加了難度。對該病毒使用細胞進行增殖，目前已傳至第8代，且能出現穩定的病變，有望對新疫苗的研制提供幫助。因該病是豬場新病，對其認知比較有限，且發病率較高、傳播快、豬場損失大，對豬場短期及長期的影響難以預估，需要進一步研究其傳入源頭、防控方法，做好防控方案。

致謝：本實驗是在華南農業大學獸醫學院、人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室、農業部獸用疫苗創制重點實驗室和廣東省獸用生物制品技術研究與應用企業重點實驗室完成。感謝廣東省生豬產業體系創新團隊基金的資助。

[1] FALLAUX F J， BOUT A， VAN DER VELDE I， et al. New helper cells and matched early region 1-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses [J]. Hum Gene Ther，1998， 9(13)： 1909-1917.

[2] VANNUCCI F A， LINHARES D C，BARCELLOS D E， et al. Identification and complete genome of Seneca Valley virus in vesicular fluid and sera of pigs affected with idiopathic vesicular disease， Brazil [J].Transbound Emerg Dis，2015， 62(6)： 589-593.

[3] 趙曉亞，伍綺文，伍子嫻，等.國內首株豬塞內加谷病毒(Seneca Valley virus)的分離鑒定[J].中國預防獸醫學報 ，2016，38(11)：839-843.[2017-08-21].

[4] REDDY P S， BURROUGHS K D，HALES L M， et al. Seneca Valley virus， a systemically deliverable oncolytic picornavirus， and the treatment of neuroendocrine cancers [J]. J Natl Cancer Inst， 2007，99(21)： 1623-1633.

[5] LEME R A， Zotti E， Alcantara B K，et al. Senecavirus A： An emerging vesicular infection in Brazilian Pig Herds [J]. Transbound Emerg Dis，2015， 62(6)： 603-611.

[6] CANNING P， CANON A， BATES J L， et al. Neonatal mortality，vesicular lesions and lameness associated with Senecavirus A in a U.S.sow farm[J]. Transbound Emerg Dis，2016，63(4)： 373-378.

2017-08-31)