中藥復(fù)方多糖對不同MHC B—LβⅡ基因型雞新城疫抗體和免疫球蛋白IgG、IgM含量的影響

楊紅洋+朱曉慶+商云霞+谷新利+郭曉

摘要：為探究MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性對中藥復(fù)方多糖免疫調(diào)節(jié)劑量的影響，采用PCR-SSCP方法將500羽黃麻肉雞按不同MHC B-LβⅡ基因型分組，再將各組分成高、中、低劑量中藥復(fù)方多糖組和空白對照組。分別于8日齡皮下注射50.0、25.0、12.5 mg/mL中藥復(fù)方多糖和生理鹽水各0.2 mL/只，連續(xù)注射7 d，于21、42、56、70日齡各組隨機取5只試驗雞，翅靜脈采血分離血清，測定血清中新城疫（newcastle disease，簡稱ND）抗體和IgG、IgM的含量。結(jié)果顯示，多糖能提高MHC B-LβⅡ不同基因型雞新城疫抗體和IgG、IgM含量，且高劑量組中藥復(fù)方多糖組中AB基因型個體血清中新城疫抗體含量最高，AA基因型個體血清中IgG、IgM含量最高；中、低劑量中藥復(fù)方多糖組中AB基因型個體血清中新城疫抗體含量和IgG、IgM含量最高。表明中藥復(fù)方多糖能提高不同MHC B-LβⅡ基因型雞的免疫力，且中藥復(fù)方多糖對不同MHC B-LβⅡ基因雞的最適免疫調(diào)節(jié)劑量不同。

關(guān)鍵詞：中藥復(fù)方多糖；MHC B-LβⅡ基因；新城疫；免疫球蛋白IgG和IgM；雞

中圖分類號： S853.74 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0168-05

收稿日期：2016-11-29

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31460673）。

作者簡介：楊紅洋（1987—），男，山東菏澤人，碩士研究生，研究方向為臨床獸醫(yī)學(xué)。E-mail：hongyangy527@126.com。

通信作者：商云霞，高級實驗師，從事動物疫病防治研究，E-mail：shangyunxia@shzu.edu.cn；谷新利，博士，教授，從事中藥制劑開發(fā)與應(yīng)用方面研究，E-mail：xlgu@shzu.edu.cn。 免疫能力的高低決定了機體抵抗病原能力的大小，直接影響經(jīng)濟動物的生長和生產(chǎn)。注射疫苗能有效地提高機體抵抗病原的能力，并且當疫苗與免疫增強劑配合使用時能顯著增強疫苗的防疫效果。目前，國內(nèi)外廣泛使用的油乳劑、鋁膠類等化學(xué)性免疫增強劑常具有副作用大、局部刺激性強、致癌等弊端。大量研究表明，從中草藥中提取的多糖不僅能增強機體免疫力，還具有毒副作用小、殘留量低等優(yōu)點，成為開發(fā)療效確定、低毒免疫增強劑的理想藥物。

雞主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，簡稱MHC）最初是作為具有高度多態(tài)性的紅細胞抗原而被認識，之后將該基因的基因座標記為B，即B復(fù)合體[1]，是一個與機體免疫應(yīng)答、抗病性能密切相關(guān)的多基因家族，具有高度的多態(tài)性。雞MHC至少包含3個亞區(qū)，即B-F、B-L、B-G區(qū)[2]。其中，B-L區(qū)基因編碼MHCII類分子，主要負責(zé)遞呈外源性抗原，供CD4+T細胞識別，誘導(dǎo)細胞因子分泌，調(diào)節(jié)機體抗體的產(chǎn)生，參與機體細胞免疫和體液免疫反應(yīng)[3]。MHC B-LβⅡ基因是MHCII類抗原的結(jié)合區(qū)，具有豐富的多態(tài)性和功能特異性[4]。

有研究表明，多糖能被MHCII分子呈遞而被αβ-T細胞的TCR（T cell receptor）直接或者間接識別，激活B淋巴細胞，誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生[5]。而雞MHC基因多態(tài)性使得不同個體對相同抗原有不同免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致機體免疫功能存在個體差異，進而可能影響中藥多糖最適免疫增強劑量。因此，本研究采用PCR-SSCP方法對試驗雞進行MHC B-LβⅡ基因分型后，給予不同劑量中藥復(fù)方多糖，通過測定各組試驗雞新城疫抗體和IgG、IgM等2種免疫球蛋白含量，探討MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性對中藥復(fù)方多糖提高雞體液免疫的最佳使用劑量是否有影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物 中藥復(fù)方由當歸、黨參、熟地、川芎、山楂、何首烏、淫羊藿、麥冬、茯苓、補骨脂和黃芪11味中藥組成，各單味藥均購自新疆石河子市醫(yī)藥公司。中藥多糖（質(zhì)量百分濃度w=77.10%）由石河子大學(xué)化工學(xué)院提供。用滅菌蒸餾水將中藥復(fù)方多糖配制成高劑量（50 mg/mL）、中劑量（25 mg/mL）、低劑量（12.5 mg/mL）3個質(zhì)量濃度。

1.1.2 藥品與試劑 新城疫活疫苗購自新疆石河子市八師獸醫(yī)站；雞新城疫抗體（NDV-Ab）酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自北京城林生物技術(shù)有限公司；雞IgG、IgM ELISA檢測試劑盒購自上海藍基生物有限公司；血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 試驗動物及分組 500羽1日齡黃麻肉雞購自新疆石河子市孵化場，臨床檢查其健康情況。根據(jù)MHC B-LβⅡ基因第2外顯子PCR-SSCP的檢測結(jié)果進行分組，再將各組分成高、中、低劑量中藥多糖組和空白對照組。分別于8日齡皮下注射50.0、25.0、12.5 mg/mL中藥復(fù)方多糖及生理鹽水各 0.2 mL/只，連續(xù)注射7 d。

所有試驗雞于7日齡進行新城疫疫苗的點眼和滴鼻免疫，27日齡進行2免，并且均采用相同的飼養(yǎng)方法、飼養(yǎng)條件、飼料品質(zhì)和飼養(yǎng)管理進行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.4 試驗儀器 酶標儀（美國熱電FC型號）、微量移液器、恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 分別采集500羽雞的外周血，按照DNA提取試劑盒說明書提取雞全血DNA，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計 參照GenBank收錄的雞MHC B-LβⅡ基因序列（NC_006103.2）第2外顯子信息，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成引物設(shè)計和合成，擴增目的條帶大小為308 bp，上游引物Forward：5′-CTGAATACTGGAAC AGCAACG-3′，下游引物Reverse：5′-ACCACTTCACCTC GATCTCC-3′。endprint

1.2.3 PCR擴增 擴增反應(yīng)總體積為20 μL，其組成為Mix 12 μL，上、下游引物各1 μL，基因組DNA 1 μL，滅菌ddH2O 5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 保存。

1.2.4 PCR-SSCP基因型檢測 3 μL PCR產(chǎn)物與8 μL上樣緩沖液（98%甲酰胺，0.025%溴酚藍，0.025%二甲苯青，10 mmol EDTA）混勻后98 ℃水浴變性10 min，立即冰浴 10 min。樣品在8%非變性聚丙烯酰氨凝膠中電泳。電泳結(jié)束后，進行銀染并用聚焦成像系統(tǒng)進行拍照。

1.2.5 雞血清新城疫抗體和IgG、IgM的含量測定 每組抽取5只試驗雞，于21、42、56、70日齡翅靜脈采血，常規(guī)分離血清。根據(jù)雞新城疫抗體及IgG、IgM酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA）檢測試劑盒說明書進行操作，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定樣品在450 nm波長處的吸光度（D值），并根據(jù)ELISA檢測試劑盒中標準品濃度及其對應(yīng)的D值獲得標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的D值利用回歸方程計算出相應(yīng)樣品的新城疫抗體和IgG、IgM的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均數(shù)±標準差（x±s）表示。采用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較。所有統(tǒng)計分析結(jié)果以P<0.05作為差異顯著性的判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-SSCP基因型檢測

對所有DNA樣品進行PCR-SSCP基因型檢測，發(fā)現(xiàn)有5種基因型，即AA基因型（共186羽），AB基因型（共180羽），BB基因型（共68羽），AC基因型（共35羽），AD基因型（共31羽）（圖1）。

2.2 中藥復(fù)方多糖對不同MHC B-L βⅡ基因型雞血清中新城疫抗體含量的影響

由表1可知，與空白對照組相比，各劑量中藥復(fù)方多糖均能提高不同基因型雞新城疫抗體含量，但在同一劑量中藥復(fù)方多糖組和空白對照組中，不同基因型雞血清中新城疫抗體含量不同。其中，高劑量中藥復(fù)方多糖組21、42日齡AB基因型雞血清中新城疫抗體含量顯著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），56日齡AB基因型的新城疫抗體含量顯著高于AC、AD基因型（P<0.05），70日齡AB基因型的新城疫抗體含量顯著高于AA、AC、AD基因型（P<0.05）；中劑量中藥復(fù)方多糖組21日齡AB基因型雞血清中新城疫抗體含量顯著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AC基因型的新城疫抗體含量顯著高于AA、BB、AD基因型（P<0.05），42日齡AB基因型的新城疫抗體含量顯著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AC基因型的新城疫抗體含量顯著高于AD基因型（P<0.05），56日齡AB基因型的新城疫抗體含量顯著高于AA、BB、AD基因型（P<0.05），70日齡AB基因型的新城疫抗體含量顯著高于AD基因型（P<0.05）；低劑量中藥復(fù)方多糖組21日齡AB基因型雞血清中新城疫抗體含量顯著高于BB、AC、AD基因型（P<0.05），AA基因型的新城疫抗體含量顯著高于AC、AD基因型（P<0.05），42日齡AB基因型的新城疫抗體含量顯著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AA基因型的新城疫抗體含量顯著高于BB、AD基因型（P0.05）；空白對照組各日齡AA基因型雞血清中新城疫抗體含量略高于AB、BB、AC、AD基因型，但無顯著性差異（P>0.05）。

2.3 中藥復(fù)方多糖對不同MHC B-L βⅡ基因型雞血清中IgG含量的影響

由表2可知，與空白對照組相比，各劑量中藥復(fù)方多糖均能提高不同基因型雞的IgG含量，但在同一劑量中藥復(fù)方多糖組和空白對照組中，不同基因型雞血清中的IgG含量不同。其中，高劑量中藥復(fù)方多糖組21、42日齡時AA基因型雞血清中IgG含量略高于AB、BB、AC、AD基因型，但無顯著性差異（P>0.05），56日齡時AA基因型的IgG含量顯著高于AC、AD基因型（P<0.05），70日齡時AA基因型的IgG含量顯著高于BB、AC、AD基因型（P005）。

2.4 中藥復(fù)方多糖對不同MHC B-L βⅡ基因型雞血清中IgM含量的影響

由表3可知，與空白對照組相比，各劑量中藥復(fù)方多糖均能提高不同基因型雞IgM含量，但在同一劑量中藥復(fù)方多糖組和空白對照組中，不同基因型雞血清中IgM含量不同。其中，高劑量中藥復(fù)方多糖組21日齡AA基因型雞血清中IgM含量顯著高于AB、BB、AC、AD基因型（P<0.05），42日齡時AA基因型的IgM含量顯著高于BB、AC、AD基因型（P<005），56、70日齡時AA基因型的IgM含量顯著高于AB、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AB基因型的IgM含量顯著高于AD基因型（P<0.05）；中劑量中藥復(fù)方多糖組各日齡AB基因型雞血清中IgM含量顯著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），并且21日齡時AA基因型的IgM含量顯著高于AD、AC基因型（P<0.05）；低劑量中藥復(fù)方多糖組21日齡時AB、AA基因型雞血清中IgM含量顯著高于BB、AD基因型（P<0.05），42日齡時AB、AA基因型的IgM含量顯著高于AC基因型（P<0.05），56日齡時AB基因型的IgM含量顯著高于BB、AC、AD基因型（P<0.05），70日齡時AB基因型的IgM含量顯著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AA基因型的IgM含量顯著高于AC、AD基因型（P<0.05），BB基因型的IgM含量顯著高于AD基因型（P<0.05）；空白對照組各日齡AB基因型雞血清中IgM含量顯著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），并且在42日齡時AA基因型的IgM含量顯著高于AC基因型（P<0.05），70日齡時AA基因endprint

型的IgM含量顯著高于AC、AD基因型（P<005）。

3 討論

新城疫是由新城疫病毒（newcastle disease virus，簡稱NDV）引起的一種雞急性、敗血性、熱性以及高度接觸性的傳染病，一旦發(fā)病，在雞群中會迅速傳播，造成雞的大批死亡。新城疫抗體滴度是雞對新城疫疾病免疫狀態(tài)的一個重要指標，能夠反映出雞對新城疫的免疫水平，同時也能反映出雞的體液免疫水平[6-7]。楊慶芳等研究了黃芪多糖（ASP）、淫羊藿多糖（EPP）和板藍根多糖對雞新城疫疫苗免疫效果的影響，發(fā)現(xiàn)3種中藥多糖均可提高新城疫HI抗體效價[8]；Liang等的研究證實，泰山刺洋槐多糖（Taishan Robinia pseudoacacia polysaccharides，簡稱TRPP）作為免疫佐劑可促進新城疫疫苗免疫的雛雞免疫器官發(fā)育，提高新城疫疫苗抗體效價，而且還可以提高十二指腸中SIgA的含量[9]。在本試驗中，與空白對照組相比，高、中、低劑量中藥復(fù)方多糖均能不同程度提高雞ND抗體含量，并且在42日齡時達到峰值，之后逐漸降低，其主要原因是本試驗中27日齡時使用的是新城疫活疫苗，它在接種后7～9 d可產(chǎn)生保護力，接種后2周抗體可達到峰值。

IgG、IgM是由活化的B淋巴細胞產(chǎn)生的主要免疫球蛋白，反映體液免疫狀況[10]。其中，IgG是血清和體液中抗體的主要成分，其含量占整個血清免疫球蛋白的70%～75%，主要參與機體再次體液免疫應(yīng)答，具有調(diào)理吞噬作用、凝集反應(yīng)和沉淀抗原、中和病原體和毒素、活化補體傳導(dǎo)途徑的作用[11]。IgM含量占免疫球蛋白總量的10%，是活化B細胞受抗原刺激后產(chǎn)生最早的免疫球蛋白[12]。IgM具有很強的抗原結(jié)合能力，在機體初期的體液免疫防御中有著重要的地位。陳強等在雛雞日糧中添加黃芪多糖之后發(fā)現(xiàn)雛雞IgG、IgM 2種免疫球蛋白的分泌量增加[13]；何雯娟等研究表明，黃芩多糖能夠提高雞的免疫器官指數(shù)，并且能夠提高雞免疫球蛋白水平，對雞的免疫能力有提高作用[14]。本試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，高、中、低劑量中藥復(fù)方多糖在各日齡均能不同程度地提高雞血清中的IgG、IgM含量，增強了雛雞免疫力，與文獻報道結(jié)果一致。

自MHC基因發(fā)現(xiàn)以來，已有大量的研究表明該基因的突變會引起不同個體對相同抗原表現(xiàn)出不同的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致機體免疫功能存在個體差異。劉立波研究了雞MHC B-L基因SNPs單倍型與綿羊紅細胞抗體滴度（SRBC）、禽流感（AI）及新城疫（ND）抗體滴度等5個免疫性狀關(guān)系，結(jié)果表明，每個免疫性狀與多個突變位點存在顯著相關(guān)，且有多個優(yōu)勢單倍型，反映了不同個體之間存在免疫應(yīng)答能力的差異[15]。在本試驗的空白對照組中，不同MHC B-LβⅡ基因型雞ND抗體和IgG、IgM含量不同，其中，AA基因型雞血清中ND抗體含量略高于AB、BB、AC、AD基因型，AB基因型雞血清中的IgG、IgM含量略高于其他基因型雞，表明MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性會引起機體免疫功能的個體差異。周偉等研究發(fā)現(xiàn)，不同MHC基因型狼山雞的IgG、IgM含量存在一定差異[16]，這與本研究結(jié)果一致。

另外，中醫(yī)藥自古就講求用藥個體化，基因組學(xué)的發(fā)展為個體化用藥提供了理論支持。當遺傳變異和藥物療效之間的相互作用逐漸受到人們關(guān)注時，將基因組的研究應(yīng)用于藥物治療領(lǐng)域逐漸增多。隨著各國學(xué)者從細胞、分子、基因等不同水平對多糖免疫調(diào)節(jié)機理的深入研究，發(fā)現(xiàn)從中草藥中提取的多糖不僅能增強機體免疫力，也是一種T細胞依賴性抗原，它能被MHCⅡ類分子處理和呈遞，進而被TCR識別[5]，參與機體細胞免疫和體液免疫反應(yīng)。在本試驗中，當對不同MHC B-LβⅡ基因型雞進行中藥復(fù)方多糖處理后，不同劑量中藥復(fù)方多糖組中MHC B-LβⅡ的優(yōu)勢基因型不同。其中，高劑量中藥復(fù)方多糖組中AB基因型個體ND抗體含量最高，AA基因型個體IgG、IgM含量最高，中、低劑量中藥復(fù)方多糖組中AB基因型個體ND抗體含量和IgG、IgM含量最高。出現(xiàn)不同劑量中藥復(fù)方多糖組中優(yōu)勢基因型不同的原因可能是：（1）MHC基因豐富的多態(tài)性會導(dǎo)致MHCII類分子抗原肽結(jié)合槽的結(jié)構(gòu)不同，TCR在識別被呈遞的細胞表面抗原時也要識別細胞上的MHCII類分子，中藥多糖中的活性成分或雜質(zhì)作為一種外來抗原被MHCII類分子提呈給T細胞的能力和激活B細胞的能力不同，導(dǎo)致不同濃度中藥復(fù)方多糖組中不同基因型個體T、B淋巴細胞增殖能力及抗體產(chǎn)生量不同，免疫功能存在差異；（2）免疫系統(tǒng)對抗原的感知有數(shù)量和濃度上的敏感性差異，多糖的濃度過高或者過低均不會產(chǎn)生較高的免疫應(yīng)答，從而引起機體免疫水平的差異；（3）免疫性狀除受MHC B-LβⅡ基因調(diào)控外，還受到其他突變位點或者基因的調(diào)控，不同的突變位點引起的免疫性狀的變化不同，可對抗體和免疫球蛋白的產(chǎn)生具有調(diào)節(jié)作用。

以上結(jié)果說明，MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性使雞的免疫能力產(chǎn)生個體差異，并且對提高雞血清中的ND抗體含量和IgG、IgM含量的最適多糖濃度會有一定影響。

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