小肽氨基酸組成對體外培養的奶牛乳腺組織乳蛋白合成的影響

周苗苗+崔景香

摘要：為研究不同二肽對奶牛乳腺組織中乳蛋白合成的影響，在體外培養的奶牛乳腺組織培養液中分別添加不同的賴氨酸二肽：賴氨酸-賴氨酸（Lys-Lys）、賴氨酸-組氨酸（Lys-His）、賴氨酸-苯丙氨酸（Lys-Phe）、賴氨酸-亮氨酸（Lys-Leu）和賴氨酸-蘇氨酸（Lys-Thr），等量取代培養液中10%游離賴氨酸（賴氨酸總濃度為210 μg/mL）進行培養，試驗結束后收集乳腺組織和培養液分別檢測基因表達和乳蛋白合成。結果表明，同游離Lys和Lys-Thr、Lys-Lys、Lys-His二肽相比，Lys-Leu和Lys-Phe顯著提高了乳腺組織中αs1酪蛋白基因的表達（P<0.05）；5種肽結合Lys均顯著提高了小肽轉運載體2（PepT2）的mRNA豐度（P<0.05），Lys-Phe和Lys-Leu比等量的Lys-Thr、Lys-Lys和Lys-His更能促進PepT2基因的表達（P<0.05）。說明小肽不同的氨基酸組成可影響奶牛小肽的攝取和乳蛋白的合成，同親水性氨基酸組成的小肽相比，疏水性氨基酸組成的小肽更能促進乳腺αs1酪蛋白基因的表達。

關鍵詞：小肽；氨基酸；賴氨酸二肽；乳蛋白；小肽轉運載體2；奶牛乳腺組織；豐度；αs1酪蛋白基因

中圖分類號： S823.9+11 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0166-02

收稿日期：2016-04-29

基金項目：山東省濰坊市科技發展計劃（編號：2015GX077）。

作者簡介：周苗苗（1983—），女，山東聊城人，博士，副教授，主要從事反芻動物泌乳生理研究。E-mail：zhoumm0329@163.com。 乳腺組織能攝取血液循環中的小肽（2～3個氨基酸組成）作為乳蛋白合成的前體物質，小肽在反芻動物乳腺蛋白合成中發揮重要作用[1-2]。很多研究證實，給體外培養的奶牛乳腺上皮細胞培養液中添加適當濃度的必需氨基酸如蛋氨酸（methionine，Met）、賴氨酸（lysine，Lys）、纈氨酸（valine，Val）、亮氨酸（leucine，Leu）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、蘇氨酸（threonine，Thr），小肽均能促進酪蛋白的基因表達和乳蛋白合成[3-9]。目前關于小肽添加量對乳蛋白合成的影響研究較多，而小肽的氨基酸組成對乳蛋白合成影響的研究較少。因此，本試驗初步探討了不同氨基酸組成的含Lys二肽對體外培養的奶牛乳腺組織乳蛋白合成的影響。

1 材料與方法

1.1 奶牛乳腺組織體外培養

取泌乳中期的中國荷斯坦奶牛乳腺組織，清洗并剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小。將組織塊種植于6孔板上，置于二氧化碳培養箱中（37 ℃，5%CO2），待組織貼壁后每孔添加2 mL培養液。培養液成分為基礎培養液DMEM（dulbeccos modified eagles medium）-F12（Gibco，美國）添加1%谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、5 μg/mL 胰島素（Sigma，美國）、500 ng/mL催乳素（Sigma，美國）、1 μg/mL氫化可的松（Sigma，美國）以及10%胎牛血清（FCS，杭州四季青生物工程公司）。

1.2 試驗設計

試驗處理培養液中去除胎牛血清、補充幾種必需氨基酸[Phe、Met、Lys、Leu、Val、異亮氨酸（isoleucine，Ile）、蘇氨酸（threonine，Thr）、組氨酸（histidine，His）]，并按試驗設計調整相應氨基酸和小肽的濃度。分別用培養液中Lys總量（210 μg/mL）10%肽結合Lys[Lys-Lys/（LL）、Lys-His/（LH）、Lys-Phe/（LP）、Lys-Leu/（LU）、Lys-Thr/LT]替代等量的Lys。試驗處理48 h后，分別收集乳腺組織和培養液用于總RNA提取和總蛋白含量測定。每個處理重復3次。

1.3 RNA提取和cDNA合成

用Trizol（Invitrogen，美國）提取組織中的總RNA。RNA純度以紫外吸光法檢測（D260 nm/D280 nm>1.80）。抽提的RNA溶解后立即用于第1鏈cDNA的合成（PrimeScriptTM RT reagent Kit反轉錄試劑盒，TaKaRa）。合成的cDNA貯存于-20 ℃，備用。

1.4 實時熒光定量PCR（real-time PCR）

采用實時熒光定量PCR方法檢測mRNA的表達。αs1酪蛋白、小肽轉運載體2（oligopeptide transporter 2，PepT2）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的實時熒光定量專用引物見表1。PCR反應在96孔板中進行，反應體系為2 μL cDNA模板+18 μL PCR反應液（SYBR Premix Ex TaqTM Real Time PCR試劑盒，TaKaRa）。純水替代cDNA模版作為陰性對照。反應條件為：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，40個循環；60 ℃ 34 s。ABI7 500實時定量序列檢測軟件（Applied Biosystems，美國）自動讀取循環數（CT）值，GAPDH、αs1酪蛋白和PepT2的擴增效率分別為100.9%、100.1%、101.3%，mRNA相對變化值用公式2-ΔΔCT進行計算。

1.5 DNA總量和培養液中總蛋白質含量測定

用Trizol提取組織中的DNA總量，用紫外吸光度法測定DNA的純度（D260 nm/D280 nm>1.80）和含量。DNA含量作為“組織數量/細胞數量”的代表，用于校正培養液中的蛋白質

含量。將冷的丙酮沉淀培養液中的蛋白質溶于含1 mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，隨后根據Bradford的方法[9]用蛋白質檢測試劑盒（博士德，武漢）檢測培養液中的總蛋白質含量，并以此代表培養液中的乳蛋白含量。以試驗組DNA校正乳蛋白含量[蛋白質質量（mg）同DNA質量（μg）的比值]同對照組DNA校正乳蛋白含量的比值作為最終結果進行比較。endprint

1.6 統計分析

所有數據用Excel軟件進行處理，用SAS軟件 PROC-GLM 程序進行統計分析。當P<0.05時，認為差異顯著。

2 結果與分析

同游離Lys和其他Lys二肽相比，Lys-Leu、Lys-Phe可顯著提高乳腺組織中αs1酪蛋白基因的表達（P<0.05），其中Lys-Phe組αs1酪蛋白mRNA豐度最高（圖1-A）。同對照組相比，Lys二肽替代組乳蛋白合成量差異不顯著（圖1-B）。

5種肽結合Lys的添加均顯著提高了PepT2的mRNA豐度（P<0.05，圖2）。不同氨基酸殘基組成的小肽對PepT2基因表達的影響不同。由圖2可見，Lys-Phe和Lys-Leu比等量的Lys-Thr、Lys-Lys和Lys-His更能促進PepT2基因的表達（P<0.05）。

3 結論與討論

小肽的轉運是一個復雜的過程，影響因素較多。除肽鏈長度外，肽的氨基酸殘基組成是影響肽吸收的另一個重要因素。一般而言，L型氨基酸組成的小肽要比D型氨基酸組成的小肽更易吸收；中性氨基酸組成的小肽比酸堿性氨基酸組成的小肽更易被動物吸收。在本試驗中，同Lys-His、Lys-Thr、Lys-Lys相比，Lys-Leu、Lys-Phe顯著增加了乳腺組織中αs1酪蛋白mRNA豐度（P<0.05）。分析小肽的氨基酸組成可以發現，同親水性和帶電荷的氨基酸殘基（如Thr、Lys和His）組成的小肽相比，疏水性和體積較大的氨基酸殘基（如Phe和Leu）組成的小肽更能促進乳腺中αs1酪蛋白的基因表達和乳蛋白合成。這些結果表明，小肽在促進乳蛋白合成方面的效果受其氨基酸組成的影響。

小肽的吸收主要依賴于小肽轉運載體系統。哺乳動物體內主要的小肽轉運載體包括PepT1和PepT2。在奶牛乳腺上皮細胞中則僅有PepT2表達[7]。這些肽轉運系統不僅可以轉運小肽，還可以轉運與肽結構類似的藥物。與氨基酸（AA）轉運機制不同，小肽是逆濃度梯度轉運，而且主要依賴H+或Ca2+濃度進行轉運。與游離氨基酸（FAA）吸收慢、吸收時耗能高相比，小肽轉運系統具有轉運速度快、耗能低等特點。小肽與FAA相互獨立的吸收機制，有助于減輕由于FAA相互競爭共同吸收位點而產生的吸收抑制。小肽載體對底物具有廣泛的適應性，幾乎能夠轉運所有的二肽和三肽[10]。但肽載體對底物構象具有嚴格的特異性，它對N末端含D型AA的耐受性比C末端為D型的高，而全D型的肽不能作為底物。另外，小肽轉運載體對由疏水性和體積較大的氨基酸殘基組成的小肽具有高親和力；而對由親水性和帶電荷的氨基酸殘基組成的小肽親和力較低[11]。本試驗中5種肽結合Lys的添加均顯著提高了PepT2的mRNA豐度（P<0.05）。PepT2是一種底物親和力高，但易飽和的轉運載體，當底物濃度增加，同時乳腺組織又有攝取小肽的需求時，只能通過增加PepT2的數量來實現。PepT2在奶牛乳腺小肽攝取過程中發揮著關鍵作用，其蛋白數量同其轉運小肽的多少呈正相關關系[6，12]。因此，PepT2的表達增強也說明了乳腺對小肽的攝取增加。此外，不同氨基酸殘基組成的賴氨酸小肽對PepT2基因表達的影響不同。Lys-Phe和Lys-Leu比等量的Lys-Thr、Lys-Lys、Lys-His更能促進PepT2基因的表達（P<005）。這一結果同Lys-Phe和Lys-Leu對αs1酪蛋白的基因表達影響結果一致。以上結果說明，小肽不同的氨基酸殘基組成可以影響奶牛乳腺上皮細胞小肽的攝取，進而影響乳蛋白的合成。

Lys-Lys、Lys-His、Lys-Leu、Lys-Phe、Lys-Thr對奶牛乳腺組織乳蛋白合成的促進作用依賴于其氨基酸殘基的理化性質。同親水性氨基酸組成的小肽相比，疏水性氨基酸組成的小肽更能促進乳腺αs1酪蛋白基因的表達。

參考文獻：

[1]Tagari H，Webb K，Theurer B，et al. Mammary uptake，portal-drained visceral flux，and hepatic metabolism of free and peptide-bound amino acids in cows fed steam-flaked or dry-rolled sorghum grain diets[J]. Journal of Dairy Science，2008，91（2）：679-697.

[2]Mabjeesh S J，Kyle C E，MacRae J C，et al. Vascular sources of amino acids for milk protein synthesis in goats at two stages of lactation[J]. Journal of Dairy Science，2002，85（4）：919-929.

[3]Wang S. Peptide-bound methionine can be a source of methionine for the synthesis of secreted proteins by mammary tissue explants from lactating mice[J]. The Journal of Nutrition，1996，126（6）：1662.

[4]Pan Y，Bender P K，Akers M，et al. Methionine-containing peptides can be used as methionine sources for protein accretion in cultured C2C12 and MAC-T cells[J]. The Journal of Nutrition，1996，126（1）：232.endprint

[5]Wu H H，Yang J Y，Zhao K. Effects of methionine-containing dipeptides on casein αs1 expression in bovine mammary epithelial cells[J]. Journal of Animal Feed Science，2007，16（S2）：7-12.

[6]Zhou M M，Wu Y M，Liu H Y，et al. Role of oligopeptide transporter 2 in bovine mammary gland phenylalanine dipeptide uptake[J]. Chin Anim Nutr，2011，23（8）：1303-1308.

[7]Zhou M M，Wu Y M，Liu H Y，et al. Effects of tripeptide and lactogenic hormones on oligopeptide transporter 2 in bovine mammary gland[J]. J Anim Physiol An N，2011，95（6）：781-789.

[8]Zhou M M，Wu Y M，Liu H Y，et al. Effects of phenylalanine and threonine oligopeptides on milk protein synthesis in cultured bovine mammary epithelial cells[J]. J Anim Physiol An N，2015，99（2）：215-220.

[9]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Anal Biochem，1976，72（1-2）：248-254.

[10]Daniel H，Kottra G. The proton oligopeptide cotransporter family SLC15 in physiology and pharmacology[J]. Pflügers Archiv，2004，447（5）：610-618.

[11]Matthews D M. Protein absorption[M]. New York：Development and Present State of the Subject，1991.

[12]Takahashi K，Masuda S，Nakamura N，et al. Upregulation of H+-peptide cotransporter PepT2 in rat remnant kidney[J]. American Journal of Physiology （Renal Physiology），2001，281（6）：1109-1116.楊紅洋，朱曉慶，商云霞，等. 中藥復方多糖對不同MHC B-LβⅡ基因型雞新城疫抗體和免疫球蛋白IgG、IgM含量的影響[J]. 江蘇農業科學，2017，45（18）：168-172.endprint