來源于西洋梨的蘋果莖溝病毒分離物基因組分子特性研究

張雪嬌+王利平+趙振軍+鄭銀英+陳婕+崔百明

摘要：為了獲得來源于西洋梨紅貝雷沙寄主潛帶蘋果莖溝病毒（ASGV）分離物的基因組全長序列，并明確其分子特性，采用RT-PCR、RACE末端克隆及生物信息學方法，對ASGV分離物基因組全長進行序列測定，并對其序列特點進行分析。結果發現，來源于西洋梨的ASGV-HB分離物的基因組全長序列為6 496 nt（GenBank登錄號：KU605672），含有2個開放閱讀框ORF1、ORF2及2個可變區Ⅵ、Ⅶ。序列分析表明ASGV-HB與GenBank登錄的18個ASGV分離物的基因組全長核苷酸序列同源性為80.6%～87.7%；ORF1和ORF2編碼的氨基酸同源性分別為843%～92.3%和94.4%～98.7%；Ⅵ和Ⅶ可變區的氨基酸序列同源性分別為22.9%～68.8%和48.8%～922%；系統發育樹分析顯示，來源于不同國家的相同寄主的ASGV分離物聚集為同一分支。結果表明，ASGV的分子變異無地域相關性，具有一定的寄主選擇性，研究結果為進一步探究ASGV的群體遺傳進化機制及其防治提供了重要的分子信息。

關鍵詞：梨；蘋果莖溝病毒；基因組全長序列；系統發育樹分析；同源性

中圖分類號： S436.611.1+9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0043-05

收稿日期：2016-05-07

基金項目：國家自然科學基金（編號：31201488）；國家梨產業技術體系（編號：nycytx-29-08）。

作者簡介：張雪嬌（1990—），女，河南周口人，碩士，研究方向為植物分子遺傳學。E-mail：yaqifeixue62@sina.com。

通信作者：崔百明，博士，副教授，研究方向為植物分子遺傳學。E-mail：2247237543@qq.com。 蘋果莖溝病毒（apple stem grooving virus，ASGV）為β-線性病毒科（Flexiviridae）發狀病毒屬（Capillovirus）的代表種[1]，是一種嚴重危害果樹產業的潛隱性病毒。ASGV感染梨樹后一般不產生明顯的癥狀，但對產量和品質有嚴重的影響，給果樹生產帶來嚴重的經濟損失。且ASGV一旦感染便較難脫除，脫除率僅為68.9%[2]。ASGV存在多種分子變異，目前尚未報道西洋梨寄主ASGV分離物基因組全長序列信息，了解ASGV的分子序列變異特點為研究ASGV的群體遺傳和果樹防治提供重要的分子依據。自1965年Waterworth首次報道蘋果被感染ASGV后，陸續在梨、杏、柑橘、百合、獼猴桃、櫻桃等[3-7]植株上發現該病毒。研究明確ASGV基因組含有2個重疊開放閱讀框（open reading frame，ORFs），分別編碼多聚蛋白（polyprotein）和運動蛋白（MP），多聚蛋白包含4個結構域，分別為甲基轉移酶（Met）、類木瓜蛋白酶（P-Pro）、解旋酶（Hel）、RNA聚合酶（RdRp）和外殼蛋白（CP）[8]；ORF2編碼36 ku運動蛋白（MP），與復制酶和CP之間存在重疊[9]。ASGV基因組中存在2個可變區（variable regions），稱為Ⅵ和Ⅶ，Ⅴ～Ⅰ可變區在基因組523～570 aa位置處，Ⅶ可變區在復制酶和CP之間，位于1 583～1 868 aa位置處跟ORF2區域存在重疊。Liebenberg等通過對Ⅵ和Ⅶ區進行壓力選擇分析及系統發育樹分析，發現ASGV的多樣性與寄主存在一定的相關性[10]。目前GenBank登錄了來源于日本百合分離物CTLV-L和CTLV-Li-23，韓國砂梨分離物ASGV-P、德國蘋果分離物ASGV-AC和印度日本蘋果分離物ASGV-P209及來自中國臺灣柑橘分離物CTLV-K和CTLV-LCd-NA-1等18個ASGV分離物的全基因組序列，而國內外尚未報道來源于西洋梨寄主的ASGV分離物基因組全長序列。本研究根據GenBank上登錄的ASGV分離物基因組全長序列設計引物，并結合RACE技術首次從西洋梨品種紅貝雷沙中獲得ASGV分離物，命名為ASGV-HB，分析了其基因組結構并進行生物信息學分析，明確其分子進化地位以及該病毒與地域起源和寄主種類的相關性，旨在為進一步探究果樹ASGV的群體遺傳和防治提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 材料

紅貝雷沙枝條于2010年4月采自中國農業科學院鄭州果樹研究所，取枝條韌皮部作為檢測材料，采用引物ASGV-U（5′-CCCGCTGTTGGATTTGATACACCTC-3′）/ASGV-2（5′-GGAATTTCACACGACTCCTAACCCTCC-3′）[11]，經 RT-PCR 檢測證實感染ASGV；通過芽尖組織培養獲得的離體植株保存于華中農業大學“國家果樹無毒種質資源室內保存中心”，取其葉片和莖尖作為本研究提取核酸的材料。

1.2 總RNA的提取

參照報道的CTAB法[12-13]，取待檢材料嫩葉和莖尖0.1 g，加液氮研磨成粉末，后加入2%的CTAB緩沖液[2% CTAB、1.5 mol/L NaCl、2% PVP-40、100 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）、20 mmol/L EDTA]和2% β-巰基乙醇，65 ℃水浴后加入等體積水飽和酚 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇[25 ∶ 24 ∶ 1]，取上清加入2.5倍體積無水乙醇和10% 3 mol/L醋酸鈉（pH值5.2）沉降RNA，溶于DEPC水中，-80 ℃保存。

1.3 RT-PCR擴增基因組全長序列

根據GenBank上登錄的ASGV（GenBank登錄號：D16681）基因組序列保守區域設計引物，對ASGV-HB部分片段進行擴增并送公司測序，結合測序結果設計引物擴增其間隔序列。RT-PCR體系20 μL：總RNA 2 μg、6堿基隨機引物1 μL，加RNase Free dH2O補足10 μL，混勻后90 ℃溫浴 7 min，冰浴3 min，后加入5× M-MLV Buffer 4 μL、dNTPs 1 μL、RRI 0.5 μL、M-MLV 0.5 μL和RNase Free dH2O 4 μL。反應條件：37 ℃ 1.5 h，-20 ℃備用。endprint

PCR反應體系25 μL：10×Taq DNA polymerase Buffer（Mg2+）2.5 μL、dNTPs 0.5 μL、引物0.5 μL、Taq DNA Polymerase 0.25 μL、cDNA 2 μL、加水補足25 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s（可變），72 ℃ 1 min（可變），34個循環；72 ℃延伸10 min。采用5′RACE和3′RACE（TaKaRa公司）技術獲得5′端和3′端序列，送至上海生工生物公司測序。

1.4 ASGV基因組全長序列克隆和序列分析

選取經PCR鑒定為陽性的菌液提交至上海生工生物工程公司武漢分公司測序，采用Vector NTI Advance 11.5.3完成對序列的拼接，多重比對用BioEdit、RDP4等生物學軟件完成，系統發育樹構建采用DNAMAN（7.0）、MEGA6.0軟件，Neighbor-Joining法進行分析，設置1 000次重復，并隱藏了支撐值低于50的數值。

2 結果與分析

2.1 來源于中國西洋梨ASGV-HB分離物基因組全長核苷酸序列分析

將擴增得到的序列利用Vector NTI Advance 11.5.3軟件進行拼接，獲得ASGV-HB分離物基因組全長為6 496 nt（不含PloyA尾），其序列遞交GenBank，獲得的登錄號為KU605672。利用在線工具對其進行核苷酸編碼的開放閱讀框預測（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），ASGV-HB基因組結構與報道的ASGV分離物一致，可編碼2個重疊的開放閱讀框，為ORF1（37～6 354 nt）和ORF2（4 788～5 750 nt），分別編碼2 105 aa分子量為241 ku的多聚蛋白和320 aa分子量為36 ku的蛋白；多聚蛋白含有甲基轉移酶、木瓜蛋白酶、解旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶以及位于基因組C末端27 ku的外殼蛋白。5′UTR含有36個核苷酸，3′UTR 含有142個核苷酸。通過BioEdit軟件對ORF1氨基酸進行多重比對發現，ASGV-HB基因組中存在與其他ASGV分離物基因組相似的2個可變區，分別為Ⅵ（532～570 aa）和Ⅶ（1 538～1 868 aa）。Ⅶ區與ORF2部分區域重疊。因此，基于預測的蛋白保守功能結構域，ASGV-HB分離物基因組結構見圖1。將ASGV-HB分離物與GenBank上收錄的來源于不同寄主及不同地域的18個ASGV分離物的基因組全長序列及部分編碼區氨基酸進行同源性比較， 結果（表1、表2）表明，ASGV-HB與此18個ASGV分離物的基因組全長核苷酸序列相似性為80.6%～87.7%。其中ASGV-HB全長序列與日本蘋果上的P-209分離物全長序列相似性最高，為87.7%；ORF1和ORF2氨基酸同源性分別為

843%～92.3%和94.4%～98.7%，可變區Ⅵ（532～570 aa）和Ⅶ（1 583～1 852 aa）氨基酸相似性分別為22.9%～688%和48.85%～92.2%，5′端UTR和3′端UTR核苷酸相似性分別為100%和98.6%。

將ASGV-HB和GenBank數據庫上收錄的來源于不同國家或地區的蘋果、梨、柑橘和百合寄主的18個ASGV分離物基因組全長序列進行系統發育樹分析（圖2）。結果表明，19個ASGV分離物可聚為3個組群，分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。Ⅰ組群分為2個分支，其中來源于日本的百合Li-23和L聚為1個分支，ASGV-HB分離物為獨立分支，與日本和中國的蘋果、柑橘和梨分離物（YTG、HH、CHN、MTH、P209和T47）聚為Ⅰ組群。Ⅱ組群由3個分支組成，其中來源于美國和中國寄主的柑橘分離物（分別為STJ、XHC、K、Lcd-NA-1、PK、ML）聚集為1個分支；來源于印度和德國的蘋果寄主AC和P12的分離物聚集為另一個分支，來源于中國砂梨的分離物ASGV-J2單獨為1個分支；來源于韓國寄主的梨SK分離物單獨聚為Ⅲ組。

2.2 ASGV-HB分離物mp基因核苷酸序列分析

ASGV-HB分離物與報道的18個分離物mp基因核苷

酸序列同源性為78.5%～96.4%，與報道的中國砂梨分離物ASGV-J2相似性最高。進而對其ASGV分離物的mp基因在核苷酸水平上進行系統發育樹分析，結果表明，共分析的19個分離物分為2個組群，分別命名為Ⅰ和Ⅱ組群。Ⅰ組群包含2個分支，其中來源于中國和美國的柑橘mp分離物均聚為1個分支，來源于南非、印度和德國的梨與蘋果寄主的mp分離物聚為另一個分支。Ⅱ組群主要分為2個分支，其中ASGV-HB西洋梨分離物與來源于中國的砂梨J2分離物聚為同一分支；來源于中國和日本的蘋果、梨、柑橘和百合分別聚集為同一個分支的隨寄主而選擇的不同簇（圖3）。

2.3 ASGV-HB分離物cp基因核苷酸序列分析

將ASGV-HB分離物與選取的GenBank上登錄的來源于中國、日本、南非、印度、韓國、德國的蘋果、梨、百合、柑橘和竹子寄主上的34個ASGV分離物基于cp基因序列的同源性為88.85%～95.5%，與來源于日本的P209蘋果分離物的同源性為95.2%。進而對cp基因進行系統發育樹分析，結果（圖4）表明，來源于不同寄主的35個ASGV分離物可分為3個組群，分別命名為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。Ⅰ組群包含2個分支，其中來源于南非的蘋果獨立成簇，與中國不同地區柑橘的cp基因分離物聚為1個分支； 來源于巴西、日本、中國、印度、南非和

德國的梨、蘋果、柑橘和竹子的cp分離物分別聚集為同一個分支的隨寄主而選擇的不同簇，其中ASGV-HB cp基因分離物與來源于南非、巴西、日本和中國的梨與蘋果的cp分離物（A19、HPHF15、T47、P209和MP220）聚為此分支的同一簇；來源于中國的蘋果和柑橘聚為第Ⅱ組；來源于美國的柑橘單獨成簇，與來源于印度的蘋果聚為第Ⅲ組。endprint

3 討論與結論

本研究采用RT-PCR結合末端RACE法首次對采集自中國農業科學院鄭州果樹研究所西洋梨紅貝雷沙樣品的ASGV分離物，即ASGV-HB的基因組進行擴增和測序，獲得其全長序列為6 496 nt（不含ployA），包含2個完整的ORFs。其中ORF1編碼含有4個保守結構域的復制酶蛋白（Rep）以及外殼蛋白（CP），ORF2編碼運動蛋白（MP），以及序列變異明顯的Ⅵ和Ⅶ區。報道顯示，ASGV的cp和mp基因均通過亞基因組表達[14]，cp通過亞基因組表達引起寄主系統感染，在cp亞基因組（subgnomic RNA，sgRNA）編碼區上游存在轉錄起始位點AUG及cp sgRNA表達所需的6堿基保守核心啟動子序列UUAGGU，共同調控cp基因表達，同時對ASGV的侵染活性有重要影響[15]。本研究得到的ASGV-HB基因組序列 5 602～5 607 nt位置處含有此六堿基序列UUAGGU，此序列為cp sgRNA起始轉錄位點的核心堿基序列。在其后 5 640～5 642 nt 位置處推測為cp sgRNA的起始位點AUG。

為了進一步明確其分子序列特性和遺傳進化關系，將ASGV-HB分離物與GenBank上登錄的來源于國內外的梨、蘋果、柑橘和百合共4種寄主的18個ASGV分離物進行基因組核苷酸水平相似性比較，結果表明，ASGV-HB分離物與來源于日本的蘋果分離物P209相似性最高，且在系統發育樹中聚為同一組群同一分支（表2、圖2）。對19個分離物進行mp基因水平上的序列分析結果也顯示，ASGV-HB分離物與P209位于同一組群，但是聚集為不同分支，與來源于中國的砂梨J2分離物聚集為同一分支，遺傳距離最近。另外，我們對ASGV-HB分離物與GenBank登錄的34個分離物進行cp基因遺傳進化關系分析，結果也表明，來源于不同國家和地區的寄主分離物聚集為同一組群同一分支。因此，基于ASGV基因組全長核苷酸、mp和cp基因核苷酸水平上的遺傳進化分析均表明，ASGV具有分子變異特點，顯示出與寄主的相關性。進而分析了ASGV-HB分離物Ⅵ和Ⅶ區氨基酸序列，結果表明，ASGV-HB分離物Ⅵ區氨基酸序列同源性僅為229%～68.8%，Ⅶ區同源性為48.8%～92.2%，且遺傳進化關系也揭示了該分離物與來源于蘋果和梨寄主的分離物進化關系較近。趙磊研究結果表明ASGV的cp基因分子變異趨勢具有一定的寄主選擇性，不存在明顯的地理差異[16]。本研究結果與Liebenberg等[10]報道的ASGV分離物變異區Ⅵ和Ⅶ的進化分析也揭示了遺傳進化關系與寄主有相關性，而與地理位置無任何關聯相似。推測可能與不同國家間種質材料交換而導致了攜帶該病毒的分子遺傳進化與來源無相關性有關。研究結果為進一步研究ASGV的群體遺傳和深入探討其進化機制提供了重要的分子信息，也為深入探究其基因組致病性功能及構建其侵染性克隆提供了材料。

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