車前子降糖活性部位的化學成分研究

彭慶華　韓竹箴　童仁超　胡信權　楊啟明　祁萌　石燕紅　王崢濤　楊莉

[摘要]該文研究車前子降糖活性部位的化學成分。前期研究表明車前子60%乙醇提取物對高脂飼料誘導糖尿病模型小鼠的血糖及糖耐量具有一定改善作用。該文進一步應用硅膠、ODS、Sephadex LH20柱色譜，中壓制備液相、薄層制備等色譜技術對車前子的60%乙醇提取物進行化學成分研究，共分離了8個化合物，并根據化合物的理化性質結合應用波譜技術鑒定了化合物結構，分別為車前子萜A（1）、iridolactone（2）、pedicularislacton（3）、rehmaglutin C（4）、京尼平苷酸（5）、phydroxylphenylglycerol（6）、4（2羥乙基）1，2苯二酚（7）、3buten2one4[3（βDglucopyranosyloxy）4hydroxyphenyl]（8）。其中，化合物1～5為環烯醚萜類，6～8為酚酸類。其中化合物1為新的天然產物，化合物2～4，6，8為首次從車前科植物中分離得到。

[關鍵詞]車前子； 化學成分； 降糖活性； 環烯醚萜； 酚酸類

[Abstract]The chemical constituents of Plantaginis Semen with hypoglycemic effect was investigated in this paper The previous results of the in vivo hypoglycemic effect showed that 60% ethanol extract of Plantaginis Semen decreased the levels of FBG and improved the glucose tolerance in high fat diet（HFD）induced diabetic C57BL/6 mice Then， in the present study， the above potential bioactive extract was separated and purified by silica gel， ODS， Sephadex LH20 column chromatography， medium pressure liquid chromatography（MPLC）and preparative HPLC The structures of isolated compounds were identified by physicochemical properties and spectral analyses Eight compounds were obtained and identified as 4， 4a， 5， 7atetrahydro7（hydroxymethyl）cyclopenta[c]pyran3（1H）one（1）， iridolactone（2）， pedicularislacton（3）， rehmaglutin C（4）， geniposidic acid（5）， phydroxylphenylglycerol（6）， 1， 2benzenediol4（2hydroxyethyl）（7）， and 3buten2one4[3（βDglucopyranosyloxy）4hydroxyphenyl]（8） Among them， compounds 15 were iridoids， and 68 were phenolic acids Compound 1 was a new natural product， and compounds 24， 6 and 8 were isolated from the Plantaginaceae family for the first time.

[Key words]Plantaginis Semen； chemical constituents； hypoglycemic； iridoid； phenolic acid

車前子為歷史悠久的常用中藥，始載于《神農本草經》，為車前科車前屬植物車前Plantago asiatica L.或平車前P. depressa Willd.的干燥成熟種子 [1]。性寒，味甘，具有清熱，利尿通淋，滲濕止渴，止瀉，明目，祛痰的功效，常用于熱淋濕痛、水腫脹滿、暑濕泄瀉、目赤腫痛和痰熱咳嗽等癥狀。全國各地均有分布，主產于江西、河南。目前，國內外對車前子的研究表明其主要的化學成分有環烯醚萜類、苯乙醇苷類、黃酮類、生物堿類、多糖類以及三萜類、甾醇類化合物等[24]。本課題組在前期藥理研究中發現車前子具有良好的降糖活性，車前子60%乙醇提取物，對高脂飼料誘導糖尿病模型小鼠的空腹血糖及糖耐量均有所改善[5]。為進一步闡明車前子的降糖活性的物質基礎，本實驗對車前子降糖活性提取物的化學成分進行了研究，從中分離得到8個化合物，分別鑒定為車前子萜A（1）、iridolactone（2）、pedicularislactone（3）、rehmaglutin C（4）、京尼平苷酸（5）、phydroxylphenylglycerol（6）、4（2羥乙基）1，2苯二酚（7）、3buten2one4[3（βDglucopyranosyloxy）4hydroxyphenyl]（8）。其中化合物1為新的天然產物，化合物2～4，6，8為首次從車前科中分離得到。

1材料

Bruker AV400和AV600型核磁共振波譜儀（TMS為內標）；LC 3000型液相色譜儀（北京創新通恒科技有限公司）；YMC Pack ODSA色譜柱（10 mm×250 mm，5 μm）；柱色譜硅膠（200～300 目，青島海洋化工廠）；硅膠GF254薄層板（青島海洋化工廠）；Sephadex LH20 （GEHealthcare，BioSciences AB）；ODS（Sepax TechnologiesInc）；H103型大孔樹脂（鄭州勤實科技有限公司）；電子分析天平，購自塞多利斯科學儀器有限公司（Sartorius，Germany）；羅氏卓越型血糖儀及血糖試紙，購自德國羅氏診斷有限公司（Roche，Germany）。試劑均為分析純或色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）。endprint

實驗所用車前子于2016年4月采購安徽省亳州市滬譙藥業有限公司（產地江西省，批號15120306642），經上海中醫藥大學吳立宏研究員鑒定為車前科車前屬車前草P. asiatica的干燥成熟種子，標本保存于上海中醫藥大學中藥研究所標本室。

2提取與分離

車前子30 kg，粉碎至粗粉后用10倍60%乙醇回流提取2次，每次3 h，濾過濃縮至無乙醇味，后經大孔樹脂柱色譜吸附后用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液并濃縮干燥，得粗提物397 g。經硅膠柱色譜分離，二氯甲烷甲醇（20∶1）至二氯甲烷甲醇水（2∶1∶02）梯度洗脫得4個組分（P1～P4）。P1通過ODS（MeOHH2O，1∶19～1∶0）柱色譜梯度洗脫，得到4個組分（P11～P14），P11和P12先后經Sephadex LH20柱色譜（MeOHH2O，1∶1和1∶0）和制備薄層板色譜純化（展開劑為ethyl acetateMeOHH2O，6∶1∶01）等得到化合物2（12 mg）和3（15 mg），P13和P14經Sephadex LH20柱色譜（MeOHH2O，1∶1）后通過薄層制備（展開劑為ethyl acetateMeOHH2O，4∶1∶01）得到化合物6（16mg）和7（17 mg）。P2經ODS（MeOHH2O，0∶1～4∶1）柱色譜梯度洗脫，再經Sephadex LH20柱色譜（MeOH）后通過薄層制備（展開劑為ethyl acetateMeOHH2O，4∶1∶01）得到化合物1（21 mg）。P3經ODS（MeOHH2O，0∶1～4∶1）柱色譜梯度洗脫，再經Sephadex LH20柱色譜（MeOHH2O，1∶1）后通過薄層制備（展開劑為ethyl acetateMeOHH2O，4∶1∶01）得到化合物4（10 mg）和8（16 mg）。化合物5（31 mg）則是由P4在甲醇溶劑中析出再經反復重結晶得到。

3結構鑒定

化合物1 白色無定形粉末，易溶于甲醇。HRESIMS顯示準分子離子峰為m/z 167068 8 [M-H]-（計算值 C9H12O3，167070 8），結合其1H和13CNMR數據確定其分子式為C9H12O3，不飽和度為4。1HNMR譜中顯示有2個連有氧原子的亞甲基信號（δH 410，1H，d，J=137 Hz，H10a； 416，1H，d，J=137 Hz，H10b； 438，1H，dd，J=40，117 Hz，H1a； 443，1H，dd，J=40，117 Hz，H1b）。根據13CNMR和DEPT譜數據，該化合物有3個次甲基、4個亞甲基和2個季碳，其中有1對雙鍵碳（δC 1289，C7； 1428，C8），1個酯基碳（δC 1770，C3）信號。結合其不飽和度可推測該化合物具有雙圓環結構。在1H1H COSY譜中，三取代雙鍵上的質子H7與C6、C9和C10相關，而C8相對于C7偏低場，可推斷連氧亞甲基C10與C8直接相連；H1與C9相關可推測C1與C9連接；H5與C4，C6，C9相關，可推測C5分別與C4，C6，C9相連。在HMBC譜中H10則與C7，C8，C9相關，所以推測C9與C8連接，C6與C7相連；H1和H4均與C9相關，C1較C4偏低場，可推測C4與C3相連，C1連接氧原子再與C3相連形成內酯。綜上所述可確定該化合物結構為4，4a，5，7a tetrahydro 7（hydroxymethyl）cyclopenta[c] pyran 3（1H） one結構見圖1，命名為車前子萜A。經文獻查閱該化合物曾在白花敗醬醇的全合成研究中得到，但并未命名[68]。因此，鑒定化合物4為新的天然產物，在本研究中進行了碳、氫波譜數據全歸屬并首次全面報道了其13CNMR譜數據，見表1。1HNMR（MeOD，600 MHz）δ：209（1H，d，J=173 Hz，H6a），237（1H，dd，J=41，150 Hz，H4a），277（1H，m，H4b），280（1H，m，H6b），305（1H，m，H5），324（1H，m，H9），410（1H，d，J=137 Hz，H10a），416（1H，d，J=137 Hz，H10b），438（1H，dd，J=40，117 Hz，H1a），443（1H，dd，J=40，117 Hz，H1b），569（1H，s，H7）。

化合物2白色無定形粉末，易溶于甲醇。1HNMR（MeOD，600 MHz）δ：254（1H，dd，J=43，151 Hz，H4b），268（1H，m，H5），288（1H，dd，J=76，151 Hz，H4a），3，35（1H，m，H9），414（H，d，J=150 Hz，H10a），417（H，d，J=150 Hz，H10b），431（1H，dd，J=41，118 Hz，H1b），441（1H，dd，J=41，118 Hz，H1a），442（1H，overlap，H6），575（1H，m，H7）； 13CNMR（MeOD，150 MHz）數據見表1。以上波譜數據與文獻[9]對比，故可鑒定該化合物為iridolactone。

化合物3白色無定形粉末，易溶于甲醇。1HNMR（MeOD，600 MHz）δ：271（2H，m，H4），303（1H，m，H6），331（1H，m，H5），372（2H，m，H10），418（1H，d，J=150 Hz，H9a），426（1H，d，J=150 Hz，H9b），546（1H，d，J=74 Hz，H1），588（1H，m，H8）； 13CNMR（MeOD，150 MHz）數據見表1。以上波譜數據與文獻[10] 對比，故可鑒定該化合物為pedicularislactone。

化合物4白色無定形粉末，易溶于甲醇。1HNMR（MeOD，500 MHz）δ：251（1H，dd，J=49，186 Hz，H4b），282（1H，m，H5），301（1H，dd，J=110，186 Hz，H4a），370（1H，d，J=121 Hz，H10b），393（1H，d，J=121 Hz，H10a），420（2H，s，H9），453（1H，s，H6），60（1H，s，H7）； 13CNMR（MeOD，125 MHz）數據見表1。以上波譜數據與文獻[11]對比，故可鑒定該化合物為rehmaglutin C。endprint

化合物5無色針狀結晶，易溶于甲醇。1HNMR（MeOD，600 MHz）δ：211（1H，dd，J=77，162 Hz，H6a），273（1H，t，J=76 Hz，H9），283（1H，dd，J=84，162 Hz，H6b），325（1H，m，H5），419（1H，d，J=144 Hz，H10a），431（1H，d，J=144 Hz，H10b），516（1H，d，J=76 Hz，H1），581（1H，s，H7），752（1H，s，H3）； 13CNMR（MeOD，150 MHz）數據見表1。以上波譜數據與文獻[12] 對比，故可鑒定該化合物為京尼平苷酸（geniposidic acid）。

化合物6白色無定形粉末，易溶于甲醇。1HNMR（MeOD，400 MHz）δ：358（1H，m，H9a），366（1H，m，H9b），371（1H，m，H8），453（1H，d，J=64 Hz，H7），676（1H，d，J=85 Hz，H3），676（1H，d，J=85 Hz，H5），722（1H，d，J=85 Hz，H2），722（1H，d，J=85 Hz，H6）； 13CNMR（MeOD，100 MHz）數據見表1。以上波譜數據與文獻[13]對比，故可鑒定該化合物為phydroxylphenylglycerol。

化合物7白色無定形粉末，易溶于甲醇。1HNMR（MeOD，400 MHz）δ：267（2H，t，J=73 Hz，H7），368（2H，t，J=73 Hz，H8），653（1H，dd，J=20，89 Hz，H6），666（1H，d，J=20 Hz，H5），668（1H，d，J=80 Hz，H2）； 13CNMR（MeOD，100 MHz）數據見表1。以上波譜數據與文獻[14]對比，故可鑒定該化合物為4（2 羥乙基）1，2苯二酚。

化合物8白色無定形粉末，易溶于甲醇。1HNMR（MeOD，600 MHz）δ：236（3H，s，H10），668（1H，d，J=161 Hz，H8），691（1H，d，J=84 Hz，H5），725（1H，dd，J=21，84 Hz，H6），758（1H，d，J=161 Hz，H7），759（1H，d，J=21 Hz，H2）； 13CNMR（MeOD，150 MHz）數據見表1。以上波譜數據與文獻[15] 對比，故可鑒定該化合物為3buten2one4[3（βDglucopyranosyloxy）4hydroxyphenyl]。

4討論

環烯醚萜類化合物是車前子藥材中主要的活性成分之一，大多以九碳骨架含環戊烷結構單元的單萜化合物及其衍生物，如京尼平苷酸和大車前草苷等，具有良好的舒張血管、降低心率等藥理活性[16]。本研究活性導向分離所得5個環烯醚萜類化合物中以京尼平苷酸的含量最高，且京尼平苷酸被證明有明顯的降血糖作用[17]，其他4個環烯醚萜類化合物與京尼平苷酸苷元結構相似，其降血糖活性與構效關系值得深入探討。本研究獲得的3個酚酸類的降血糖作用如何，也有待于進一步的闡明與揭示。

[參考文獻]

[1]中國藥典一部[S]. 2015：68.

[2]鄭秀棉， 楊莉， 王崢濤 車前子的化學成分與藥理活性研究進展[J]. 中藥材， 2013（7）：1190.

[3]Chiang L C， Ng L T， Chiang W， et al. Immunomodulatory activities of flavonoids， monoterpenoids， triterpenoids， iridoid glycosides and phenolic compounds of Plantago species[J]. Planta Med， 2003， 69（7）：600.

[4]Nhiem N X， Tai B H， Van Kiem P， et al. Inhibitory activity of Planta go major L on angiotensin I converting enzyme[J]. Arch Pharm Res， 2011， 34（3）：419.

[5]Yang Q M， Qi M， Tong R C， et al. Plantago asiatica L seed extract improves lipid accumulation and hyperglycemia in highfat dietInduced obese mice[J]. Int J Mol Sci， 2017， 18：1393.

[6]謝平 1白花敗醬醇的全合成研究 2螺環天然產物的全合成研究[D]. 北京：北京協和醫學院， 1997.

[7]謝平， 焦曉臻， 陳淑鳳， 等 天然產物（-）patriscabrol和（+）isopatriscabrol的全合成研究[J]. 有機化學， 2005， 25（9）：1094.

[8]Xie P， Chen S F， Liang X T Total synthesis of（+）villosol[J]. Chin Chem Lett， 1997， 8（2）：103.

[9]Akdemir Z， Calis I， Junior P. Iridoids and phenylpropanoid glycosides from Pedicularis nordmanniana[J]. Planta Med， 1991， 57（6）：584.

[10]Lin S J， Tan C H， Jiang S H， et al. C9Iridoids from Scrophularia buergeriana[J]. Helv Chim Acta， 2006， 89（11）：2789.endprint

[11]Tang H Y， Bai M M， Tian J M， et al. Chemical components from the seeds of Catalpa bungei and their inhibitions of soluble epoxide hydrolase， cholinesterase and nuclear factor kappa B activities[J]. Rsc Adv， 2016， 6（47）：40706.

[12]El Bitar H， Gramain A， Sévenet T， et al. Daphcalycinosidines A and B， new iridoidalkaloids from Daphniphyllum calycinum[J]. Tetrahedron Lett， 2004， 45（3）：515.

[13]Zeng Q， Guan B， Cheng X， et al. Chemical constituents from Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng[J]. Biochem Syst Ecol， 2013， 50：406.

[14]Nishibe S， Okabe K， Tsukamoto H， et al. The structure of forsythiaside isolated from Forsythia suspense[J]. Chem Pharm Bull， 1982， 30（3）：1048.

[15]Ohmura K， Miyase T， Ueno A Sesquiterpene glucosides and a phenylbutanoid glycoside from Hypochoeris radicata[J]. Phytochemistry， 1989， 28（7）：1919.

[16]de Kloet A D， Krause E G， Woods S C The renin angiotensin system and the metabolic syndrome[J]. Physiol Behav， 2010， 100（5）：525.

[17]Wu S， Wang G， Liu Z， et al. Effect of geniposide， a hypoglycemic glucoside， on hepatic regulating enzymes in diabetic mice induced by a highfat diet and streptozotocin[J]. Acta Pharmacol Sin， 2009， 30（2）：202

[責任編輯丁廣治]endprint