小反芻獸疫抗體檢測注意事項及結果分析

林小能

（福建省安溪縣動物疫病預防控制中心，福建安溪 362400）

小反芻獸疫抗體檢測注意事項及結果分析

林小能

（福建省安溪縣動物疫病預防控制中心，福建安溪 362400）

小反芻獸疫（PPR）又稱“羊瘟”，是傳入我國的外來動物疫病，2007年7月首次在我國西藏阿里地區暴發，至今我國的遼寧、貴州、廣西等20多個省份均發生過小反芻獸疫疫情，死亡率最高可達100%，給疫情發生地區的養羊業造成了巨大的經濟損失，我國將其列為一類動物疫病。目前，該疫病尚無有效的治療方法，主要預防措施是做好免疫預防工作，因此如何評價免疫效果在該疫病的防控工作中具有重要的意義。

小反芻獸疫；競爭ELISA；注意事項；結果分析

小反芻獸疫是一種急性、高度接觸性傳染病，主要感染山羊和綿羊，其中山羊比綿羊的易感性更強，潛伏期一般為3～10d，多數為4～5d，最長也可以達到21d，多數羊發病后10d內死亡；急性暴發期間發病率和死亡率均可達到100%；溫和發病期間，發病率仍然較高，但死亡率一般不超過50%。牛多呈亞臨床感染，并能產生抗體；豬表現為亞臨床感染，無癥狀，不排毒；野生動物也偶然發生。山羊和綿羊接種小反芻獸疫弱毒疫苗后免疫力可持續36個月以上，為做好小反芻獸疫的免疫效果評價工作，本文主要介紹小反芻獸疫競爭ELISA抗體檢測試劑盒的實驗步驟和注意事項，并對安溪縣山羊養殖場（戶）的免疫抗體水平進行分析，旨在為做好小反芻獸疫抗體監測工作提供幾點意見。

1 樣品來源

安溪縣以飼養山羊為主，本次實驗共隨機采集來自于全縣不同地理位置的小反芻獸疫免疫場（戶）43個（其中50只以上山羊養殖場（戶）19個，每場（戶）采集血清樣品10份；10～50只的山羊養殖散戶24個，每戶采集血清樣品5份；采集時間為2017年5月17日至6月28日），共310份。樣品采集使用5ml/次性注射器和離心管，采集后放入便攜式冷藏箱中；樣品當天室溫（20℃）放置1h（依室溫而定），待全血凝固并析出血清后，使用臺式高速離心機（型號：200TG16～WS）離心（8000轉離心4min，血清樣品均無溶血、無腐敗，符合檢測要求），離心后的血清樣品放入冰箱冷凍層（-15℃）保存待檢。

2 實驗儀器

10ml量筒、200ml量筒、250ml燒杯、、96孔離心管架、普力菲爾超純水機（型號：FST-I-20）、電熱恒溫鼓風干燥箱（型號：DHG-9070）、快速混勻器（型號：SK-1）、酶標分析儀（型號：RT-6000）、單道移液器（10～100uL）、單道移液器（100～1000ul）、8道移液器（30～300uL）、300ul移液槍頭、5ml離心管、一次性洗液皿、一次性吸水紙。

3 實驗試劑

小反芻獸疫競爭ELISA抗體檢測試劑盒（中國農業科學院蘭州獸醫研究所生產，批號：20170504118，有效期：2017年11月3日）：已包被的ELISA板（96孔/板）、洗滌液（25×PBST）60ml/瓶、血清稀釋液50ml/瓶、陰性對照血清400uL/瓶、陽性對照血清400uL/瓶、單克隆抗體150uL/瓶、兔抗鼠IgG-HRP結合物（酶標二抗）150uL/瓶、底物溶液（TMB）15ml/瓶、終止液25ml/瓶。

4 實驗步驟

4.1 實驗前準備

將小反芻獸疫競爭ELISA抗體檢測試劑盒從冷藏冰箱（2～8℃保存）中取出，將待檢血清從冰箱冷凍層中取出，按豎排列于96孔離心管架，并做好記錄（待檢血清設1孔、另設陽性對照血清2孔、陰性對照血清2孔、單克隆抗體對照4孔、空白對照2孔），待試劑和血清樣品恢復至室溫20～25℃（使用空調調節室溫）才可進行實驗，實驗開始時按需取出包被的ELISA板。

4.2 溶液配置

（1）使用量筒將洗滌液（25×PBST）用超純水（普力菲爾超純水機UP出水口收集）做25倍稀釋（如10ml洗滌液加240ml超純水），放入燒杯中混勻待用。

（2）使用單道移液器（100～1000μl）和單道移液器（10～100μl）將單克隆抗體和兔抗鼠IgG-HRP結合物（酶標二抗）分別用血清稀釋液進行1：100稀釋（如10μl單克隆抗體或10μl兔抗鼠IgG-HRP結合物加990uL血清稀釋液），分別放入5ml離心管中混勻，并做好標記待用。

4.3 操作步驟

4.3.1 加樣

（1）取出ELISA板用單道移液器（10～100μl）將待檢血清（50μl）和陰陽性血清（50μl）加入相應孔中，單克隆抗體孔加入血清稀釋液50μl，空白對照孔加入血清稀釋液100μl。

（2）除空白對照孔外，其余各孔用8道移液器加1：100稀釋混勻后的單克隆抗體50μl，加樣完畢后置于快速混勻器中溫柔震蕩混勻，用封板膜封板后置于電熱恒溫鼓風干燥箱（溫度設置恒溫37℃）中孵育60min。

4.3.2 洗液

（1）恒溫37℃孵育60min后取出酶標板（ELISA板），將板中的溶液甩干，將稀釋后的洗滌液（25倍稀釋后）混勻后倒入一次性洗液皿，用8道移液器加洗滌液（25倍稀釋后）300μl洗滌3次，并在吸水紙上甩干。

（2）每孔用多道移液器加入1：100稀釋后的兔抗鼠IgG-HRP結合物50μl，加樣完畢后將酶標板置于快速混勻器中溫柔震蕩混勻，用封板膜封板后，再次置于電熱恒溫鼓風干燥箱（恒溫37℃）中孵育60min。

（3）恒溫37℃孵育60min后取出酶標板，再次將板中的溶液甩干，用8道移液器加混勻后的洗滌液（25倍稀釋后）300uL洗滌3次，并在吸水紙上甩干。

4.3.3 檢測

（1）最后一次將酶標板洗板并甩干后，每孔用8道移液器加入底物溶液50μl，之后置于電熱恒溫鼓風干燥箱（恒溫37℃）避光靜置反應15min，同時將酶標分析儀接通電源預熱。

（2）取出靜置反應后的酶標板，每孔用8道移液器加入終止液50μl，并立即用酶標分析儀（設置450nm波長）檢測實驗結果（10min內測定）。

5 結果判定

陰性對照血清OD450nm值＜40%，陽性對照血清OD450nm值＞60%，空白對照PI值≥5%，試驗有效。PI值=[1-（樣品孔的OD450nm值/單抗對照孔的OD450nm值）]×100%。待檢血清PI≥45%，抗體陽性；PI＜40，抗體陰性；40%＜PI＜45%，則判定可疑，重復檢測一次，根據所測PI值進行判定，如果仍為可疑需再次檢測，或用其它方法檢測。診斷或流行病學調查時，待檢血清PI≥50%，陽性；PI＜50%，陰性。

6 注意事項

（1）洗滌液稀釋時應使用UP出水口收集的超純水，避免因水質不符合洗滌液要求，影響數據的準確性。

（2）實驗前應注意讓試劑和血清樣品均恢復至室溫時才能開始。

（3）實驗時如96孔ELISA板全部使用，單克隆抗體的稀釋液（1：100）應比實際需要量多配備10份以上，建議配置5200μl以上（50uL*104，空白對照2孔無需添加）；兔抗鼠IgG-HRP結合物應比單克隆抗體多配置2份，建議配置5300μl以上（50μl*106，96孔均需添加）；洗滌液（1：25）應比實際需要量多配備一些，需配置172.8ml以上（300μl*96*6，96孔均需添加，共洗滌6次），建議配置250ml；避免因試劑在離心管、一次性洗液皿和移液槍頭中的殘留而導致的試劑量不足，需臨時配置現象，致使反應時間不同步，影響實驗結果。

（4）酶標板加單克隆抗體的稀釋液（1：100）或兔抗鼠IgGHRP結合物的稀釋液（1：100），樣品數量少時建議使用單道移液器，量多時可倒入一次性洗液皿，再使用8道移液器添加相應試劑，以使反應時間盡量一致。

（5）實驗過程中應穿實驗服，佩戴手套、口罩，相關試劑使用后均應立即將試劑瓶旋緊，以免造成試劑的污染，影響今后的檢測；實驗結束后廢棄的移液槍頭、一次性洗液皿、一次性吸水紙、酶標板和用完的相關試劑瓶等均應交由具備相關資質的醫療廢棄物處理機構回收處理，不得隨意丟棄，以免造成外界環境的污染。

7 結果及分析

7.1 實驗結果

7.2 結果分析

安溪縣有24個鄉鎮437個行政村，有山羊養殖場（戶）的行政村204個，50頭以上山羊養殖場（戶）70個，從實驗結果可以看出，安溪縣養羊場小反芻獸疫免疫抗體水平總體比較高，共檢測50只以上山羊養殖場（戶）19個，其中抗體合格率低于70%的有3個，70～90%的有12個，達100%的有4個；共檢測10～50只山羊養殖散戶24個，其中抗體合格率低于70%的有0個，80%的有11個，達100%的有13個。總體看來安溪縣山羊小反芻獸疫的免疫抗體水平較高，免疫屏障穩固，能有效降低感染小反芻獸疫的風險，避免疫情爆發時的急速擴散而導致巨大的經濟損失。個別養羊場（戶）的免疫抗體水平偏低，可能是免疫注射部位不當（小反芻獸疫應采用頸部皮下注射）或疫苗冷鏈不完全等因素所致，今后我縣將加強小反芻獸疫的免疫預防技術指導和免疫效果監測工作，進一步提高全縣的小反芻獸疫免疫抗體水平，鞏固免疫屏障，有效地預防小反芻獸疫的發生和流行。

[1]王君瑋，王志亮.生物安全實驗室獸醫病原微生物操作技術規范[M].中國農業出版社，2009.

[2]王志國.羊小反芻獸疫的綜合防控措施[J].現代農業，2017，（4）：85.