腐乳毛霉SH12生長性能及產酶特性研究

袁華偉，閔小蘭，陸巧玲，楊澤剛，蘭著璽，徐洲，尹禮國*

(1.宜賓學院 生命科學與食品工程學院，四川 宜賓 644000；2.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；3.四川省鐘氏食品有限責任公司，四川 宜賓 644000)

腐乳毛霉SH12生長性能及產酶特性研究

袁華偉1，2，閔小蘭3，陸巧玲1，楊澤剛1，蘭著璽1，徐洲1，2，尹禮國1，2*

(1.宜賓學院 生命科學與食品工程學院，四川 宜賓 644000；2.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；3.四川省鐘氏食品有限責任公司，四川 宜賓 644000)

研究了腐乳毛霉SH12的生長性能及產酶特性。結果表明：在溫度26 ℃、pH為7.5時，生長速率最大。Ca2+，Mg2+濃度低于0.2%時，對毛霉的生長幾乎沒有影響。在36 h時，毛霉菌絲體干重達到較大值。產酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、糖化酶、脂肪酶活力分別為67.3，339.4，372.3，293.1 U/g，0.67 U/mL，以蛋白酶為主。在豆腐培養基上中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力在48 h達到最大，而酸性蛋白酶活力在60 h達到最大。研究結果可為毛霉SH12用于腐乳生產提供理論依據。

腐乳毛霉；生長性能；產酶特性

腐乳是以大豆制成的豆腐為基質，經微生物作用而形成的一種傳統發酵食品，在我國已經有上千年的歷史[1,2]。腐乳含有大量的水解蛋白質、游離氨基酸、游離脂肪、硫胺素、核黃素、煙酸、鈣、磷等營養成分，不含膽固醇；富含有機酸、醇、酯等風味物質。腐乳以豐富的營養、細膩的品質、獨特的口感及風味深受廣大消費者的喜歡[3]。

腐乳的發酵過程，是微生物及其所產生的酶不斷作用的過程。生產腐乳的微生物有毛霉、根霉、細菌，大多數使用的是毛霉[4,5]。為縮短宜賓地區腐乳制作中培菌周期、控制雜菌污染、穩定產品品質，從宜賓傳統腐乳生產作坊中分離得到1株生產效果較好的毛霉SH12，但對其生長性能及產酶特性未做深入研究[6]。腐乳中的微生物在發酵過程中產生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多種酶類，是一個復合酶系。這些酶通常都具備優良的特性，如毛霉蛋白酶水解的大豆多肽無苦腥味，且無毒無害，不產生怪味和異色等，毛霉的產酶性能直接影響到腐乳的產量和質量[7-9]。因此，研究毛霉的生長性能及產酶特性對提高腐乳的品質具有十分重要的意義。

作為傳統大豆發酵食品，腐乳日益得到國內外消費者的青睞。本文利用毛霉SH12菌株，研究溫度、pH、Ca2+和Mg2+對其生長的影響，測定了生長曲線。用福林-酚法測定蛋白酶活力，用DNS法測定糖化酶活力，用橄欖油乳化法測定脂肪酶活力，研究毛霉的產酶特性，并分析腐乳發酵過程中蛋白酶活力變化規律。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

毛霉菌種：從宜賓傳統腐乳作坊中收集毛坯，經分離純化得到的1株毛霉SH12，保藏于宜賓學院固態發酵資源利用四川省重點實驗室。

麩皮、黃豆、豆腐：購買于宜賓市綠源超市。

1.2 實驗試劑

葡萄糖、可溶性淀粉、鹽酸、冰乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉、酚酞、氯化鈣、氯化鎂、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、福林-酚試劑、碳酸鈉、酪氨酸、三氯乙酸、乳酸、乳酸鈉、聚乙烯醇(PVA)、橄欖油、95%(V/V)中性乙醇、3,5-二硝基水楊酸溶液(DNS)：均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.3 儀器與設備

LDZX-75KBS高溫滅菌鍋 上海申安醫療機械廠；JJ60384超凈工作臺 吳江市凈化設備總廠；DHP-9082生化培養箱、DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；Spectra Max M2多功能酶標儀 杭州匯爾儀器設備有限公司；PHSJ-5 pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；HH-S4水浴鍋 江蘇省金壇市醫療儀器廠。

1.4 實驗方法

1.4.1 培養基的制備

1.4.1.1 PDA液體培養基

200 g土豆切塊煮20 min后，雙層紗布過濾后，取濾液，加葡萄糖20 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min后備用。

1.4.1.2 麩皮培養基

按麩皮與水1∶2的比例配制，121 ℃滅菌30 min后備用。

1.4.1.3 固體產酶培養基

麩皮9 g、黃豆粉(過40目)1 g、水10 mL，裝入250 mL錐形瓶中121 ℃滅菌30 min。

1.4.1.4 液體產酶培養基

將50 g黃豆用水泡脹后，用豆漿機搗碎，加少量水制成500 mL豆漿，用雙層紗布過濾后，分裝到250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，于121 ℃滅菌30 min。

1.4.1.5 豆腐培養基

將豆腐切成2 cm×2 cm×1 cm的小塊，分裝在滅菌的培養皿中，每個培養皿均勻擺放2塊。

1.4.2 毛霉培養

毛霉菌種SH12接種于麩皮培養基中，28 ℃下培養2 天，用無菌水沖洗菌絲體并用滅菌后的玻璃珠打散得到孢子懸浮液。

吸取2 mL孢子懸浮液，分別接種到已滅菌的固體產酶培養基和液體產酶培養基中，混合均勻，置于28 ℃的恒溫培養箱中培養2天。培養好的固體培養物用于蛋白酶和糖化酶活力的測定，液體培養物用于脂肪酶活力的測定。

信息化平臺的優劣影響后期各類功能和需求實現，全員參與、供應商配合是保障項目成功的重要因素。系統建設過程中出現問題是正常的，針對重點問題，制定切實可行的解決方案，并且循環迭代該過程是信息化系統建設與推進的良方。結合公司物資管理系統建設過程解析，希望能夠為后續信息化系統建設提供參考。

1.4.3 毛霉生長性能的測定

1.4.3.1 溫度對毛霉生長的影響

用50 mL錐形瓶裝20 mL的液體PDA培養基，接種0.2 mL孢子懸浮液，在100 r/min搖床內分別于22，24，26，28，30，32 ℃培養24 h。取20 mL培養液過濾得到菌絲體，在110 ℃烘箱內烘干6 h，測菌絲體干重，以毛霉的菌絲體干重來確定最適生長溫度。

1.4.3.2 pH值對毛霉生長的影響

調節液體PDA培養基的pH值為6.5，7，7.5，8，8.5。在確定的毛霉最適生長溫度下100 r/min培養24 h，以毛霉菌絲體干重確定毛霉菌的最適pH值。

1.4.3.3 Ca2+，Mg2+對毛霉生長的影響

調節PDA液體培養基中的Ca2+和Mg2+濃度分別為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%。在最適溫度下，在100 r/min搖床內培養24 h。以菌絲體干重研究不同的離子濃度對毛霉生長的影響。

在最適溫度和pH值下，于100 r/min培養48 h，每3 h取樣測菌絲體干重，最后以測得的毛霉菌絲體干重制得毛霉的生長曲線。

1.4.4 酶活力的測定

1.4.4.1 蛋白酶活力的測定

2 g固體培養物，研磨后，分別加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的緩沖液20 mL，在40 ℃條件下水浴1 h，間斷攪拌，濾紙過濾，用該酶的緩沖液稀釋得到測試液。用福林-酚法，建立酪氨酸含量與吸光度關系的標準曲線，按工業酶制劑通用實驗方法測定蛋白酶活力[10]。

1.4.4.2 糖化酶活力的測定

2 g固體培養物，研磨后，加入0.1 mol/L pH 4.6醋酸-醋酸鈉緩沖液20 mL，在40 ℃條件下水浴1 h，間斷攪拌，濾紙過濾后經稀釋得到待測酶液。用DNS法，建立葡萄糖含量與吸光度關系標準曲線。參照工業酶制劑通用實驗方法，測定糖化酶活力[10-13]。

1.4.4.3 脂肪酶活力的測定

將培養好的豆漿液體培養物用濾紙過濾后，稀釋一定的倍數供測試用。用橄欖油乳化法測定脂肪酶活力[14,15]。

1.5 毛霉在豆腐坯上產蛋白酶活力的變化

將豆腐塊整齊地擺放在滅菌的培養皿中，均勻地噴涂上毛霉孢子懸浮液，然后放入28 ℃的恒溫培養箱中培養，每隔12 h取樣1次。取樣時將豆腐坯與菌絲體一同取下，每次取2 g，然后以制備蛋白酶液相同的方法，分別制成酸性、中性和堿性蛋白酶液，測定其酶活。

2 結果與分析

2.1 毛霉生長性能

2.1.1 溫度對毛霉生長的影響

溫度對毛霉SH12生長的影響見圖1。

圖1 溫度對毛霉生長的影響

毛霉在20～26 ℃區間內，毛霉菌SH12的菌絲體干重隨著溫度的升高而上升。26～32 ℃區間內，毛霉SH12的菌絲體干重隨著溫度的升高而下降，但下降速度較為緩慢。在26 ℃時，毛霉SH12的菌絲體干重達到最高，說明毛霉SH12的最適生長溫度是26 ℃。

2.1.2 pH值對毛霉生長的影響

在不同pH值下，毛霉的生長情況見圖2。

圖2 pH對毛霉生長的影響

在pH值6～7.5之間，毛霉菌絲體的干重隨著pH值的上升而上升，當pH值為7.5時，毛霉菌絲體干重達到最大。在pH值7.5～9之間，毛霉菌絲體干重隨著pH值的下降而下降，表明毛霉SH12的最適pH值為7.5。一般霉菌的最適生長pH值是6.0～6.5之間，篩選出來的毛霉SH12最適生長pH值為7.5。可能是由于該菌種分離自腐乳作坊，在腐乳發酵生產過程中所使用的豆腐塊由點鹵的方式生產，呈微堿性。微生物長期生長在一個偏堿性的環境中，經過多年的自然馴化，導致毛霉的最適生長pH值有一定的改變。

2.1.3 Ca2+和Mg2+對毛霉生長的影響

腐乳生產中使用的豆腐坯多數是由點鹵制成的，其中含有Ca2+或Mg2+。以毛霉菌絲體干重來研究Ca2+，Mg2+對毛霉的生長影響，結果見圖3。

圖3 Ca2+和Mg2+濃度對毛霉生長的影響

在添加了Ca2+后，毛霉菌絲體干重都略有下降，Ca2+濃度為0.1%～0.2%時，毛霉菌絲體干重下降不明顯，但Ca2+濃度在0.3%～0.5%時，毛霉菌絲體干重隨著Ca2+濃度的上升呈明顯的下降，Ca2+濃度為0.5%時對毛霉生長有很明顯的抑制。Mg2+濃度為0～0.2%時，毛霉菌絲體干重基本沒有太多的變化，而Mg2+濃度為0.3%～0.5%時，毛霉菌絲體干重隨著Mg2+濃度的上升而明顯下降。生產腐乳用的豆腐塊中Ca2+，Mg2+離子的含量一般不會超過0.2%，因此利用毛霉SH12發酵腐乳時，Ca2+和Mg2+對毛霉的生長幾乎沒有影響。

2.2 毛霉的生長曲線

毛霉的生長曲線見圖4。

圖4 毛霉生長曲線

由圖4可知，在前9 h內，毛霉菌的生長緩慢，毛霉SH12菌絲體基本沒有形成，在12 h后，毛霉菌絲體干重開始緩慢增加，在24～36 h之間，毛霉菌絲體干重隨著時間的增加迅速上升，在這個時間段內，其增加的速度達到最大，即培養24 h后，毛霉已經達到了最快的生長速率。在36～48 h之間，毛霉菌絲體干重增加的速度緩慢，這時毛霉菌的生長速率開始下降，可能是因為培養基中的營養物質不足，或者是在該環境中，毛霉的生長量達到飽和。由于毛霉是一種絲狀真菌，因此所測得的毛霉生長曲線是一條隨著培養時間的增長，菌絲體干重量不斷增加的曲線，只是培養時間與菌絲體干重的立方根呈線性的關系[16]。

2.3 毛霉的產酶特性

2.3.1 毛霉的蛋白酶活力

以酪氨酸含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制酪氨酸標準曲線，見圖5。

圖5 酪氨酸標準曲線

由圖5可知，標準曲線方程為：y=0.0059x-0.0038，相關系數R2=0.9996，測定結果的相關性良好。毛霉在麩皮黃豆粉固體培養基中產酸性、中性和堿性蛋白酶的酶活測定結果見表1。

表1 毛霉的產酶活力

由表1可知，毛霉菌株的蛋白酶活力中堿性蛋白酶的活力最強，中性蛋白酶活力與堿性蛋白酶活力相近，酸性蛋白酶活力最弱，這有利于毛霉菌株在中性偏堿的條件下進行發酵。以大豆為原料的豆腐中蛋白質是含量最高的有機物質，可達16.0%[17]。腐乳毛霉發酵菌種具有相應的蛋白酶系，以分解豆腐中的蛋白質，產生相應的可溶性蛋白及各種氨基酸賦予腐乳以鮮味，形成腐乳的鮮味和其他風味物質，提高腐乳的營養價值。

2.3.2 毛霉的糖化酶活力

以葡萄糖含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，見圖6。

圖6 葡萄糖標準曲線

由圖6可知，標準曲線方程為：y=1.5863x+0.0104，相關系數R2=0.9994，測定結果的相關性良好。毛霉在麩皮黃豆粉固體培養基中產糖化酶活性為293.1 U/g。糖化酶有催化淀粉水解的作用，能從淀粉分子非還原性末端開始，分解催化大分子物質為小分子物質。

2.3.3 毛霉的脂肪酶活力

毛霉在豆漿液體培養基中產脂肪酶活力為0.67 U/mL。與蛋白酶和糖化酶的活性相比，脂肪酶的活性最小。脂肪酶的作用在腐乳發酵過程中,將脂肪水解成甘油和脂肪酸，甘油進一步轉化為有機酸，這些有機酸與腐乳配料中的酒精合成各種相應的酯類，構成腐乳的特殊香氣。毛霉的脂肪酶活性雖小，但在腐乳香氣成分的形成方面具有十分重要的作用。

由表1可知，毛霉具有豐富的酶系組成，這有利于豆腐坯中蛋白質、碳水化合物、脂肪等主要成分的水解，形成多種多樣的小分子營養物質和風味成分，以保證腐乳的品質。

2.4毛霉在豆腐培養基上蛋白酶活力的變化

圖7 毛霉蛋白酶活力變化

由圖7可知，中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力隨時間變化而增加，在48 h時達到最大值，分別為234.7，243.2 U/g，然后開始下降；而酸性蛋白酶活力隨時間變化而增加，在60 h時達到最大值，為142.3 U/g，而后酶活力下降。大豆在制成豆腐的過程中，蛋白質變性凝聚而成豆腐，此時豆腐中水溶性蛋白含量為3.61%，堿溶性蛋白含量為91.25%。腐乳生產過程中，經過前期的培菌階段，毛霉繁殖產生堿性蛋白酶和中性蛋白酶活力較酸性蛋白酶活力要高，且先達到酶活力最高點。酸性蛋白酶活力遠低于中性和堿性蛋白酶活力的原因，是由于先產生的中性和堿性蛋白酶先水解豆腐中的蛋白質，生成小分子的氨基酸，而小分子的氨基酸等含氮化合物對蛋白酶的進一步合成有反饋抑制作用，所以酸性蛋白酶活力要低于中性和堿性蛋白酶，而酶活力達到最大后又隨時間變化降低。

3 結論

通過對毛霉SH12的生長特性研究，表明毛霉的最適生長溫度為26 ℃，pH值為7.5，Ca2+和Mg2+濃度小于0.2%時對其生長影響不明顯，生長曲線研究表明毛霉在24～36 h之間生長最快。

毛霉所產酶系豐富，在麩皮黃豆粉固體培養基中產酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶活力分別為67.3，339.4，372.3 U/g，糖化酶活力為293.1 U/g；在豆漿液體培養基中產脂肪酶活力為0.67 U/mL。這有利于腐乳在發酵過程中形成小分子營養物質和風味成分，以保證腐乳的品質和風味。在豆腐培養基上培養毛霉，其中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力在48 h達到最大，而酸性蛋白酶活力在60 h達到最大，之后隨時間變化而下降。研究結果可為腐乳生產提供理論依據。

[1]陳陶聲.中國釀造技術的過去、現在與將來[J].中國調味品,1988(4):8-11.

[2]趙德安.豆腐乳瑣談[J].中國釀造,1997(5):33-34.

[3]張嶺,劉景春.淺談腐乳的營養價值[J].中國調味品,2002(5):9-10.

[4]趙玉蓮,鄭學翔.豆腐乳生產用微生物(一)[J].中國調味品,1998(12):5-7.

[5]周錦繡,林奇,唐卿燕.我國腐乳生產用菌的研究現狀[J].食品科技,2007,32(11):20-23.

[6]尹禮國,閔小蘭,袁華偉,等.宜賓豆腐乳毛霉分離及應用[J].中國調味品,2017,42(2):89-92.

[7]鄧靜,林青錄,周俊清,等.毛霉蛋白酶特性研究[J].中國釀造,2005,24(5):24-26.

[8]胡巔,趙學慧.論耐熱性毛霉菌株的篩選及酶學性質[J].中國調味品,1998(1):2-6.

[9]鄭曉婷,趙新淮.毛霉蛋白酶特性研究[J].食品工業科技,2008,29(9):156-158.

[10]QB/T 1803-1993,工業酶制劑通用實驗方法[S].

[11]羅惠波,王毅,邊名鴻,等.麩曲糖化酶活力測定方法探討[J].四川理工學院學報(自然科學版),2014,27(3):6-9.

[12]孫淑琴,邵冬梅.比色法快速測定糖化酶活力新方法[J].河北省科學院學報,1997,14(2):35-39.

[13]黃丹,尚志超,袁先玲,等.瀘型大曲中根霉固態發酵產糖化酶條件研究[J].四川理工學院學報(自然科學版),2012,25(3):9-13.

[14]鄧毅,葉海梅,吳朝娟.脂肪酶活力測定研究進展[J].工業微生物,2005,35(4):36-40.

[15]王歡,何臘平,周換景,等.脂肪酶活力測定方法及其在篩選產脂肪酶微生物中的應用[J].生物技術通報,2013(1):203-208.

[16]周德慶.微生物學教程[M].北京:高等教育出版社,2011:153.

[17]馬勇.腐乳生產過程中酶活力變化和理化性質的研究[D].北京：中國農業大學,2002.

StudyonGrowthPerformanceandEnzymeProductionPropertyofMucorSH12fromSufu

YUAN Hua-wei1,2, MIN Xiao-lan3, LU Qiao-ling1, YANG Ze-gang1, LAN Zhu-xi1, XU Zhou1，2, YIN Li-guo1,2*

(1.College of Life Science and Food Engineering, Yibin University, Yibin 644000, China;2.Key Laboratory of Solid-state Fermentation Resource Utilization of Sichuan Province, Yibin 644000, China;3.Sichuan Zhongshi Foods Co.,Ltd., Yibin 644000,China)

The growth performance and enzyme production property ofMucorSH12 from sufu are investigated. The results indicate that the growth rate is the highest when the temperature is 26 ℃ and pH is 7.5. It has almost no effect on the growth ofMucorwhen Ca2+and Mg2+concentration is lower than 0.2%.Mucormycelium dry weight reaches a larger value at 36 h. The activities of acidic proteinase, neutral proteinase, alkaline proteinase, glucoamylase and lipase biosynthesized byMucorare 67.30,339.40,372.30,293.10 U/g and 0.67 U/mL respectively, and proteinases are dominant enzymes. Moreover, the activities of neutral proteinase and alkaline proteinase reach the peak values at 48 h when theMucorgrows on tofu medium, while it is 60 h for acidic proteinase. The results obtained may provide theoretical basis for applyingMucorto produce sufu.

Mucorfrom sufu;growth performance;enzyme production property

TS264.12

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.014

1000-9973(2017)11-0069-05

2017-05-20 *通訊作者

宜賓市重點科技項目(2014ZNY001)；固態發酵資源利用四川省重點實驗室項目(2016GTY003)；釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室項目(NJ2014-10)

袁華偉(1967-)，男，四川安岳人，高級工程師，博士，研究方向：食品發酵工藝及加工技術。