帕立骨化醇對糖尿病腎病大鼠尿液Podocalyxin水平的影響

蘭凱+張光偉+秦迎霞+倪菁

摘要：目的 探討帕立骨化醇對糖尿病腎病（DN）大鼠尿液足細胞表面標志蛋白Podocalyxin（PCX）的影響。方法 采用鏈尿佐菌素（STZ）腹腔注射的方法構建DN大鼠動物模型，將造模成功的大鼠隨機分為帕立骨化醇組（P組）、DN組（D組），并設置健康對照組（N組）。P組大鼠每周灌胃帕立骨化醇3次，每次劑量0.4 μg/kg，給藥12 w后檢測各組大鼠尿液PCX水平、24 h尿蛋白定量及一般生化指標。結果 與N組相比，D組和P組PCX水平和24 h尿蛋白定量明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；P組顯著低于D組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 帕立骨化醇可以通過減輕腎小球PCX蛋白的損傷，從而改善糖尿病腎病大鼠蛋白尿的產生。

關鍵詞：糖尿病腎病；帕立骨化醇；PCX

中圖分類號：R587.2 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）21-0028-03

Effects of Paricalcitol on Urine Podocalyxin Levels in Diabetic Nephropathy Rats

LAN Kai，ZHANG Guang-wei，QIN Ying-xia，NI Jing

（School of Clinical Medicine，Xi'an Medical University，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of paclitaxel on the expression of Podocalyxin（PCX）in the urine podocyte of diabetic nephropathy（DN） rats.Methods Using streptozotocin（STZ）intraperitoneal injection method to construct DN rat animal model，the successful model of the rats were randomly divided into paricalcitol group（P group），DN group（D group），and set up a healthy control group（N group）.P rats by gavage every week paricalcitol 3 times per dose 0.4 μg/kg，urine PCX levels of rats in each group after treatment for 12 w，24 h urinary protein and biochemical indices. Results Compared with N group，D group and PCX P group and 24 h urinary protein was significantly increased，the differences were statistically significant（P<0.05）；P group was significantly lower than that in D group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion Paricalcitol can reduce glomerular PCX protein damage，thereby improving proteinuria in diabetic nephropathy rats.

Key words：Diabetic nephropathy；Paricalcitol；PCX

糖尿病腎病（diabeticnephropathy）是糖尿病的主要慢性微血管并發癥之一，是目前引起慢性腎功能衰竭的主要原因。在西方國家，糖尿病腎病是終末期腎病的首要原因，在我國糖尿病腎病雖然在終末期腎病各種病因中的發生率還居原發性腎小球腎炎之后，但隨著人們生活質量的改善有逐年遞增的趨勢。糖尿病腎病一旦發展到終末期腎病必須依靠替代治療來維持，因此早期治療非常重要。近年來研究發現腎小球足細胞損傷和脫落在糖尿病腎病腎小球濾過屏障通透性的改變及蛋白尿的發生發展中起關鍵作用。PCX是腎小球足細胞足突頂端膜區的主要跨膜蛋白之一，參與維持腎小球濾過屏障正常結構。近年來有研究發現活性維生素D類似物帕立骨化醇具有減少糖尿病腎病大鼠尿蛋白及腎臟保護作用[1-2]，但具體作用機制尚不清楚，可能與改善腎小球濾過屏障結構有關，目前這方面的研究較少。本研究擬通過帕立骨化醇對糖尿病腎病大鼠尿蛋白和PCX水平的影響，探討其對腎臟保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1動物模型的建立與分組

清潔級封閉群雄性SD大鼠30只，體質量（210±20）g。20只大鼠造模，10只為健康對照組（N組）。大鼠造模后禁食10 h，單次無菌腹腔注射65 mg/kg鏈脲菌素（購于美國Sigma公司）。72 h后取尾靜脈血測空腹血糖（FBG），FBG≥16.65 mmol/L確定為糖尿病大鼠，3 w后24 h尿蛋白量≥30 mg確認糖尿病腎病大鼠模型制備成功；健康對照組注射等量的檸檬酸緩沖液。造模成功的糖尿病腎病大鼠隨機分成：帕立骨化醇治療組（P組，10只），將帕立骨化醇溶于丙二醇中，以0.4 μg/kg的劑量3次/w灌胃；糖尿病腎病組（D組，10只）。D組與N組給予等量丙二醇灌胃，連續12 w。12 w后收集24 h尿，心臟取血4～5 ml。

1.2一般指標檢測

芐乙氯銨沉淀法檢測24 h尿蛋白。自動生化儀檢測空腹血糖（FBG）、血肌酐（Scr）、血鈣、血磷和甲狀旁腺激素（PTH）。endprint

1.3尿液PCX測定

根據試劑盒操作流程，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定尿液PCX水平。

1.4統計學處理

采用SPSS17.0軟件包進行統計學分析。計量資料數據用（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。

2結果

2.1治療12 w后各組大鼠指標變化

P、D組24 h尿蛋白量、空腹血糖、肌酐和PTH均高于N組，差異均有統計學意義（P<0.05）；P組24 h尿蛋白量、肌酐顯著低于D組，差異有統計學意義（P<0.05）；P組血鈣、血磷與N組差異無統計學意義，見表1。

2.2治療12 w后各組大鼠尿液PCX水平變化

P組和D組PCX水平高于N組（P<0.05）；P組PCX水平低于D組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

3 討論

在西方國家，糖尿病腎病是終末期腎病的首要原因，在我國糖尿病腎病雖然在終末期腎病各種病因中的發生率還居原發性腎小球腎炎之后，但隨著人們生活方式的改變有逐年遞增的趨勢。糖尿病腎病是糖尿病最常見并發癥，一旦發展到終末期腎病必須依靠腎臟替代治療，因此早期干預非常重要。糖尿病腎病表現為腎小球內高灌注、高濾過、高壓力，進而出現腎小球毛細血管袢基底膜增厚和基質增生。由于糖尿病腎病患者機體存在極其復雜的代謝紊亂，一旦發展到終末期腎病，往往比其它腎臟疾病治療更加棘手。因此在糖尿病腎病早期進行積極有效地干預治療，已成為當前糖尿病和腎臟病學界十分熱點的課題。研究發現糖代謝異常、腎臟血流動力學改變、氧化應激等因素，可引起腎小球濾過屏障的損傷，導致蛋白尿的發生，而微量蛋白尿是糖尿病腎病的早期標志[3-4]。由于腎小球濾過膜因炎癥、免疫、代謝等因素損傷后濾過膜孔徑增大、斷裂和靜電屏障作用減弱，血漿蛋白質特別是清蛋白濾出，超出近端腎小管重吸收能力而形成的蛋白尿。臨床上見到持續性蛋白尿往往意味著腎臟的實質性損害。當蛋白尿由多變少時，既可反映腎臟病變有所改善，也可能是由于大部分腎小球纖維化，濾過的蛋白質減少，腎功能日趨惡化，病情加重的表現。蛋白尿已被證實是腎臟損害的獨立危險因素，有效減少蛋白尿可以延緩糖尿病腎病腎臟功能減退。

近來研究發現活性維生素D具有廣泛的生理功能，除調節體內鈣磷代謝外，還影響免疫、神經、生殖、內分泌、上皮及毛發生長等生理活動的調節。活性維生素D是一種前類固醇激素，它通過細胞內特異的維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）介導發揮其生物學活性。VDR分為兩大類：膜受體（membrance VDR）和核受體（nuclear VDR）。膜受體主要參與維持鈣磷代謝平衡，核受體則主要影響基因轉錄，以及靶蛋白合成的調節。未結合維生素D的VDR既存在于胞漿也存在于細胞核內；而與維生素D結合后的VDR即以二聚體形式轉位到細胞核內，作為轉錄因子與存在于靶基因啟動子區域的維生素D反應元件相作用，調控靶蛋白基因的轉錄。維生素D類似物的分子結構同維生素D相似，可以和VDR結合，具有與活性維生素D3相似的生物學活性。目前主要包括骨化三醇（Calcitriol， 1，25-Dihydroxycholecalciferol）、帕立骨化醇（Paricalcitol，19-nor-1，25-dihydroxyvitamin D2）和度骨化醇（doxercalciferol，1-alpha-hydroxyergocalciferol）。維生素D類似物通過結構修飾改變產生生物學效應。維生素D類似物的分子結構同維生素D相似，可以和VDR結合，具有與活性維生素D相似的生物學活性。帕立骨化醇作為維生素D類似物的一種，目前對其的研究主要集中在調節鈣磷代謝及預防佝僂病等方面的作用，近年來有關帕立骨化醇可能參與腎臟保護作用的研究越來越多。研究發現帕立骨化醇不僅具有調節鈣磷代謝的生物學作用，還可通過抑制RAS系統、炎癥因子分泌、細胞外基質沉積、系膜細胞增殖等途徑改善糖尿病腎病病理生理過程，具有獨立于鈣磷代謝以外的腎臟保護作用[5-6]。研究發現糖尿病腎病時活性維生素D水平與血漿腎素活性和血管緊張素Ⅱ呈負相關。研究表明帕立骨化醇可以使糖尿病腎病大鼠腎小管上皮間充質轉化及小管間質改變減輕，同時伴有腎保護作用，并且未發生高鈣血癥等問題[7-8]。帕立骨化醇可以通過抑制腎素合成基因表達的環腺苷酸信號通路，阻斷部分環腺苷酸與環腺苷酸反應原件結合區對腎素基因啟動子的活化，可以抑制腎素基因轉錄啟動，從而減少腎素的合成[9-11]，從而有效改善腎臟內環境，擴張腎動脈，降低腎小球內壓，改善血流動力學，起到腎臟保護作用。帕立骨化醇能通過抑制循環及腎臟局部組織腎素-血管緊張素系統活性而對腎臟具有保護作用，其保護作用不依賴于細胞外鈣磷水平的變化，在本研究中也得到證實。有研究觀察缺失VDR突變型糖尿病小鼠生長發育，發現此類小鼠體內存在強大腎素-血管緊張素系統激活作用，同時伴有嚴重腎損傷，而通過給予維生素D類似物治療，明顯改善腎損傷。研究發現腎臟部分切除的小鼠給予補充活性維生素D類似物可使足細胞損傷減少，通過降低足細胞蛋白丟失和消除足細胞過度肥大，從而減少蛋白尿及腎小球硬化。這種保護不依賴于腎小球濾過率或血壓等因素改變，也不是血液動力學機制可以解釋的，可能是通過足細胞修復或者腎小管間質損傷的修復而實現。

足細胞是腎小囊臟層上皮細胞，它附著于腎小球基底膜的外側，連同腎小球基底膜和毛細血管內皮一起構成腎小球血液濾過屏障，是各種腎小球炎癥及非炎癥損傷的靶位。足細胞的損傷在糖尿病腎病的發生發展中起了重要作用，足細胞結構和功能蛋白逐漸被人們所認識，其中PCX作為足細胞上表達的一種標志性蛋白，通過離子交換調控因子復合物對足細胞結構形成和維持起重要作用，同時也是腎小球主要帶負電荷的蛋白分子，參與形成腎小球電荷屏障[12-13]。PCX是CD34相關性唾液黏蛋白，由腎小球內皮細胞和足細胞合成，在足細胞成熟過程中固定于足細胞頂膜。PCX是腎小球足細胞足突頂端膜區的主要跨膜蛋白之一，參與維持腎小球濾過屏障正常結構。正常腎小球通過分子屏障和電荷屏障幾乎可以完全阻止血漿清蛋白分子的濾過，而足細胞PCX表達的減少將直接導致腎小球電荷屏障的陰離子分布減少，使得清蛋白更容易濾過；同時，PCX的減少也影響足細胞裂隙隔膜正常結果的維持。研究發現，多種腎臟疾病在發生腎損傷時，尿液中都可以檢測到PCX水平增加，同時伴隨腎小球基底膜的損傷，足細胞頂膜區的PCX表達也增加。研究證實腎臟損傷后，尿液中增加的PCX來源于足細胞頂膜區，而非脫落的足細胞碎片，表明尿液中PCX水平增加在腎臟損傷早期，早于足細胞從基底膜脫落以及足細胞損傷后活化的細胞膜脫落。研究發現，糖尿病腎病病人尿液中檢測到的PCX水平增加，并且伴有腎小球基底膜的損傷，足細胞頂膜區的PCX表達相應增加，同時PCX減少會影響足細胞裂孔膜正常結構維持，與糖尿病腎病蛋白尿的產生關系密切[14-15]。本研究發現在帕立骨化醇治療12 w后糖尿病腎病大鼠蛋白尿指標較未治療組明顯下降，肌酐水平也有下降，尿液中的PCX蛋白水平較未治療組有所下降，證實了其具有獨立于鈣磷代謝以外的腎臟保護作用，我們推測帕立骨化醇可能具有修復足細胞PCX蛋白損傷的作用，其作用途徑有待于經一步研究。endprint

綜上所述，糖尿病腎病大鼠會出現蛋白尿，蛋白尿是引起腎功能減退的重要原因，帕立骨化醇可以減輕腎小球PCX蛋白的損傷，從而改善糖尿病腎病大鼠蛋白尿的，改善腎臟功能，延緩糖尿病腎病的發展，給臨床上糖尿病腎病的治療提供了新思路。

參考文獻：

[1]Tuncdemir M，Ozturk M.The effects of angiotensin-II receptor blockers on podocyte damage and glomerular apoptosis in a rat model of experimental streptozotocin-induced diabetic nephropathy[J].Acta Histochem，2010（12）：234-241.

[2]Li C.Vitamin D and diabetic nephropathy[J].Curr Diab Rep，2008（8）：464-469.

[3]Chen J，Cui W，Zhang Q，et al.Low molecular weight fucoidan ameliorates diabetic nephropathy via inhibiting epithelial mesenchymal transition and fibrotic processes[J].Am J Transl Res，2015，7（9）：1553-1563.

[4]安明，張瑞霞.早期糖尿病腎病相關危險因素分析[J].醫學信息，2016，29（22）：282.

[5]Valdivielso JM，Cannata-Andía J，Coll B，et al.A new role for vitamin D receptor activation in chronic kidney disease[J].Am J Physiol Renal Physiol，2012，297（6）：1502-1509.

[6]Wang Y，Deb DK，Zhang Z，et al.Vitamin D receptor signaling in podocytes protects against diabetic nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，2012，23（2）：1977-1986.

[7]Zhang Y，Ma KL，Liu J，et al.Dysregulation of low-density lipoprotein receptor contributes to podocyte injuries in diabetic nephropathy[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2015，308（12）：1140-1148.

[8]Li YC.Vitamin D regulation of the renin-angiotensin system[J].J Cell Biochem，2013（88）：327-331.

[9]Sugimoto Y，Inazumi T，Tsuchiya S.Roles of prostaglandin receptors in female reproduction[J].J Biochem，2015，157（2）：73-80.

[10]Friis U G，Madsen K，Stubbe J，et al.Regulation of renin secretion by renal juxtaglomeru- lar cells[J].PflugersArch，2013，465（1）：25-37.

[11]Yan C L.Renoprotective effects of vitamin D analogs[J].Kidney International，2010，78 （2）：134.

[12]Wang XM，Yao M，Liu SX，et al.Interplay between the Notch and P13KAkt pathways in high glucose induced podocyte apoptosis[J].Am J Physiol Renal Physiol，2014，30（6）：205-213.

[13]Tian Y，Lv G，Yang Y，et al.Effects of vitamin D on renal fibrosis in diabetic nephropathy model rats[J].Int J Clin Exp Pathol，2014，7（6）：3028-3037.

[14]Wolf G，Chen S，Ziyadeh FN.From the periphery of the glomerular capillary wall toward the center of disease：podocyte injury comes of age in diabetic nephropathy[J].Diabetes，2005，25（6）：1626-1634.

[15]De Boer IH，Sachs M，Hoofnagle AN，et al.Paricalcitol does not improve glucose metabolism in patients with stage 3-4 chronic kidney disease[J].Kidney Int，2013，83（2）：323-330.

編輯/李樺endprint