葡萄酒中總鐵和Fe2+的改良菲洛嗪法快速測定

郭安鵲 張星星 張予林 董 鑫 陳力維

(西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100)

葡萄酒中總鐵和Fe2+的改良菲洛嗪法快速測定

郭安鵲 張星星 張予林 董 鑫 陳力維

(西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100)

通過優化菲洛嗪法測定葡萄酒中總鐵的檢測條件，以及探討Fe3+共存時菲洛嗪用量對Fe2+測定的影響，建立一種簡易可靠、能夠直接測定葡萄酒中總鐵和Fe2+的方法。結果顯示：改良菲洛嗪法測定葡萄酒中的總鐵，在0.25～2.00 mg/L質量濃度范圍內線性關系良好，檢測限為0.011 5 mg/L，加標回收率為94.31%～104.34%，變異系數范圍為0.95%～2.43%；然而，共存的Fe3+會影響對葡萄酒中Fe2+的測定，適合的顯色劑用量是菲洛嗪與總鐵摩爾比為7，在此條件下，Fe2+質量濃度的擬合準確度為101.98%～113.50%。利用該法測定葡萄酒樣品的結果表明，葡萄酒中以Fe2+為主，其在紅葡萄酒中的百分比相對較高。總之，改進的方法簡單易行、準確可靠，能夠滿足葡萄酒中鐵價態的快速定量測定，適于在葡萄酒生產中推廣應用。

葡萄酒； 菲洛嗪法； 總鐵； Fe2+； 快速測定

引言

葡萄酒氧化機制的研究表明，葡萄酒的氧化主要表現為酚類物質的氧化，銅、鐵離子特別是后者在引發和延伸氧化反應中起著關鍵的催化作用[1-3]。隨著不銹鋼罐的廣泛應用，葡萄酒中的鐵含量大幅下降，成品酒中鐵的質量濃度為0.5～5.0 mg/L[4]。然而，近年來的大量研究結果顯示，葡萄酒中鐵的離子形態及其分布是其催化氧化作用的關鍵所在，即使是微量的鐵仍能引起葡萄酒的氧化褐變，嚴重影響酒的感官質量[5-8]。

眾所周知，因所處的還原環境及酸度條件，葡萄酒中的鐵以Fe2+為主[7,9]。目前，通過固相萃取技術進行樣品前處理，然后利用原子吸收光譜法、電感耦合等離子體光譜法(ICP-OES)等檢測葡萄酒中鐵的離子存在形態[10-11]，以及利用電化學方法測定葡萄酒中的鐵價態[12]，國內外均有文獻報道。但上述方法操作復雜，檢測成本高，不適于在葡萄酒生產中推廣應用。尤其是，樣品在前處理過程中，很容易因酒樣與空氣長時間接觸、pH值調整等問題改變Fe2+/Fe3+氧化還原電子對的平衡，影響鐵形態測定的準確度和精確度。相比之下，分光光度法操作簡單、成本低，是測定葡萄酒中鐵形態的常用方法。

基于不同顯色劑與Fe2+或Fe3+作用形成特定有色絡合物的原理，利用分光光度計能夠很容易測定溶液中的Fe2+或Fe3+，由此出現了大量測定鐵形態的顯色劑。研究結果表明，由于測定Fe3+的顯色劑受限于所測溶液中氯、焦磷酸等離子的濃度要求，有關Fe2+顯色劑的研究越來越受到重視[13]。其中，菲洛嗪(Ferrozine)已經成為實踐中定量測定Fe2+應用最廣的物質[13-15]。目前，已有利用菲洛嗪法測定葡萄酒中鐵形態的研究報道[10,13]。近年來，DANILEWICZ[7]在研究白葡萄酒中的Fe2+/Fe3+比和氧化還原狀態時，以菲洛嗪分光光度法為基礎，在不改變樣品pH值的條件下，借助外推法確定葡萄酒中Fe2+的含量，很有借鑒意義。然而，與Fe3+共存時，菲洛嗪法測定Fe2+往往會受到干擾，干擾程度與Fe3+濃度及顯色劑用量有關[15-17]。ANASTCIO等[17]認為，Fe3+可與菲洛嗪作用形成絡合物，該絡合物在光照下會被還原為Fe2+-菲洛嗪，直接導致Fe2+定量檢測的結果偏高。IM等[15]在研究中則發現，即使在避光條件下，Fe3+也會干擾對Fe2+的測定，且干擾作用隨時間呈線性遞增趨勢；Fe3+濃度越高，干擾作用越明顯。在利用菲洛嗪法測定葡萄酒中鐵含量的文獻中，很少見到Fe3+對Fe2+測定影響的研究報道。

因此，本文通過在模擬葡萄酒中優化菲洛嗪法的檢測條件和方法評價，建立一種簡單易行、準確可靠、直接適于葡萄酒中總鐵測定的方法；以總鐵測定為基礎，通過優化Fe3+共存時測定Fe2+所需的菲洛嗪用量，借助多項式曲線擬合，利用外推法獲得葡萄酒中的Fe2+含量，最后通過差減法計算Fe3+的含量。

1 材料與方法

1.1 供試酒樣

模擬酒、成品白葡萄酒和紅葡萄酒。

1.2 主要供試試劑

Fe2+標準儲備液(1.79 mmol/L)：準確稱取49.78 mg FeSO4·6H2O(純度99.0%以上)，置于燒杯中溶解，迅速轉移至100 mL容量瓶，模擬酒定容至刻線。

抗壞血酸母液(1.79 mmol/L)：準確稱取31.54 mg抗壞血酸(純度99.7%)，置于燒杯中溶解，快速轉移至100 mL棕色容量瓶，模擬酒定容至刻線。

菲洛嗪母液(10.74 mmol/L)：準確稱取52.92 mg菲洛嗪(純度99.7%以上)，置于燒杯中溶解，迅速轉移至10 mL棕色容量瓶，模擬酒定容至刻線。

每次使用前，上述儲備液和母液均為新鮮配制，避光保存。所有化學試劑均為分析純，實驗用水為去離子水，所有實驗均在室溫(20℃)下進行。

1.3 儀器與設備

主要設備：UV-2450型紫外-可見光分光光度計(日本島津公司)；PHS-3C型pH計(上海精密科學儀器有限公司)；BT25S型十萬分之一天平(德國Startorius公司)；PinAAcle500型原子吸收光譜儀(美國PE公司)；Mutiwave PRO型微波消解儀(奧地利安東帕公司)。

所有玻璃和塑料器材，均置于10%(體積分數)硝酸溶液中至少浸泡24 h，用去離子水清洗3次后，晾干，備用。

1.4 原理與方法

1.4.1總鐵測定原理

在酸性條件下，菲洛嗪與Fe2+反應生成穩定的紫色絡合物[Fe(Ferrozine)3]2+，在562 nm波長處有最大光吸收，其吸光度與Fe2+質量濃度成正比[14,18]。通過加入還原劑抗壞血酸(C6H8O6)，可將葡萄酒中的Fe3+還原為Fe2+，據此測定葡萄酒中的總鐵濃度。反應式為

1.4.2模擬酒的配制及通氮氣處理

參照GUO等[8]的方法，將7 mmol/L酒石酸和11 mmol/L酒石酸氫鉀溶解到體積分數12%的乙醇溶液中，利用1.0 mol/L氫氧化鈉和1.0 mol/L鹽酸調節溶液的pH值為3.20。使用前，對模擬酒進行通氮氣處理，密封后于室溫下避光放置。

1.4.3標準曲線的繪制

分別用移液槍吸取0、25、40、80、50、100、200 μL Fe2+標準儲備液于10 mL棕色容量瓶，立即用模擬酒定容至刻線，配制0、0.25、0.40、0.50、0.80、1.00、2.00 mg/L 7個不同質量濃度梯度的Fe2+標準溶液。然后分別向各容量瓶中加入適量的抗壞血酸母液和菲洛嗪母液。最后，混勻靜置30 min后，注入10 mm石英比色皿中，以空白做參比溶液，利用分光光度計于波長562 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。每個質量濃度重復3次。

1.4.4葡萄酒中總鐵的測定

室溫下，葡萄酒開瓶后，快速吸取1 mL酒樣并移至10 mL棕色容量瓶中；向容量瓶中添加模擬酒至刻線(即酒樣被稀釋10倍，簡稱“稀釋樣”)；依次加入適量的抗壞血酸母液和菲洛嗪母液，混勻，避光放置30 min后，以稀釋樣代替樣品做空白，并以此為參比樣測定波長562 nm處的吸光度，根據標準曲線計算總鐵含量。每個酒樣重復3次。

1.4.5葡萄酒中Fe2+的測定

室溫下，葡萄酒一開瓶，就立即吸取1 mL酒樣加入事先通氮氣處理的10 mL棕色容量瓶中，添加模擬酒至刻線。隨后，直接加入適量的菲洛嗪，混勻后立即倒入比色皿中，以稀釋樣為參比，利用分光光度計于波長562 nm處每隔1 min測定一次吸光度。最后，對前10 min內的實驗數據進行多項式曲線擬合，獲得擬合曲線方程的常數項A0(截距)，即反應時間為0時絡合物所對應的吸光度。利用總鐵標準曲線，通過反推法計算Fe2+的含量。每個酒樣重復3次。

1.4.6葡萄酒中Fe3+的計算

總鐵含量減去Fe2+的含量即為Fe3+的含量。

圖2 菲洛嗪和抗壞血酸用量對總鐵測定的影響Fig.2 Effects of ferrozine and ascorbic acid on total iron determination in model wine

1.4.7數據處理方法

實驗數據的ANOVA(Duncan新復極差法)分析采用軟件SPSS Statistics 21.0處理，每個處理重復3次，其結果以平均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 菲洛嗪法測定葡萄酒中總鐵的條件優化

2.1.1檢測波長的確定

配制不同質量濃度的Fe2+標準溶液，按照實驗方法，利用分光光度計在400～700 nm(掃描間距為1.0 nm)波長范圍內掃描Fe2+與菲洛嗪形成的絡合物。由不同體系的吸收光譜(圖1)可以看出，曲線在波長562 nm處均有最大吸收，且吸光度最大，與已有的文獻報道一致[14,19]，故檢測波長選擇562 nm。

圖1 菲洛嗪與Fe2+絡合物的光吸收曲線Fig.1 Absorption spectra of Fe2+-ferrozine complex in model wine

摩爾吸光系數是衡量分光光度測定方法靈敏度的一個重要指標，在模擬酒中，菲洛嗪的摩爾吸光系數是1,10-鄰菲啰啉摩爾吸光系數的2.4倍(表1)，表明菲洛嗪是較1,10-鄰菲啰啉更為靈敏的顯色劑。

表1 顯色劑菲洛嗪與1,10-鄰菲啰啉的摩爾吸光系數Tab.1 Molar absorptivity of ferrozine and 1,10-phenanthroline in model wine

注：同行上角不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.1.2顯色劑和還原劑用量的確定

在含不同鐵形態的模擬酒中，首先加入過量的抗壞血酸，然后選擇添加不同用量的顯色劑菲洛嗪，混勻后反應30 min，測定562 nm處吸光度，結果如圖2a所示。由結果分析可知，菲洛嗪與總鐵摩爾比為2～4時，由于菲洛嗪用量不足，測定結果偏低；當摩爾比為6～12時，測定結果較為穩定，說明在模擬酒中適宜的顯色劑用量是菲洛嗪與總鐵摩爾比為6，而且顯色劑過量對測定結果無顯著影響(P>0.05)。

選擇不同用量的還原劑抗壞血酸，然后加入顯色劑(菲洛嗪與總鐵摩爾比為6)，混勻后反應30 min，測定吸光度。結果如圖2b所示，當抗壞血酸與Fe3+摩爾比為0.5時(即兩者反應的理論比值)，Fe3+的還原并不完全，測定結果偏低；當摩爾比不低于1時，反應完全且測定結果非常穩定，說明適宜的還原劑用量為抗壞血酸與Fe3+摩爾比為1。

2.1.3反應時間的確定

按照實驗方法，以及已經確定的還原劑、菲洛嗪用量，選擇不同的反應時間0、5、10、15、20、25、30、35、40 min，測定吸光度。結果如圖3所示，在反應前5 min，吸光度快速上升，5～10 min內仍緩慢增加，說明菲洛嗪和Fe2+的反應開始很快，但并未達到平衡；10～40 min內吸光度非常穩定，變化不顯著，說明10 min時反應達到平衡，且在隨后的30 min內非常穩定。

圖3 反應時間對總鐵測定的影響Fig.3 Effect of reaction time on total iron determination in model wine

關于菲洛嗪與Fe2+形成紫色穩定絡合物進行比色之前的反應時間，在最初的文獻報道中為1 min[20]；在改良方法中，也有反應30 min的報道[15]。這主要取決于溶液的組成和內部環境條件。在葡萄酒中，由于酒石酸、酚類物質、蛋白質等大分子物質均能夠與鐵形成絡合物[11,21]，影響鐵與菲洛嗪的絡合，反應達到平衡所需要的時間就相對要長。因此，考慮到葡萄酒構成的復雜性，反應時間選擇30 min。

2.1.4pH值和共存金屬離子對總鐵測定的影響

溶液的酸度直接影響金屬離子的存在狀態和絡合物的穩定性[22-23]，共存金屬離子則通過電子交換影響葡萄酒中的鐵形態[6, 24]。因此，在模擬酒中研究了共存金屬離子和pH值對總鐵測定的影響，共存金屬離子及其質量濃度的選擇參照GUO等[8]的文獻，包括0.48 mg/L Al3+、0.98 mg/L Mn2+、1.17 mg/L Zn2+和1.14 mg/L Cu2+。實驗結果表明，pH值和其他共存金屬離子對總鐵質量濃度測定均無顯著影響(表2、3)，因而優化后的菲洛嗪法可直接用于測定葡萄酒中總鐵。

表2 pH值對總鐵測定(吸光度)的影響Tab.2 Effect of pH values on total iron determination in model wine

表3 共存金屬離子對總鐵測定(吸光度)的影響Tab.3 Effect of coexisting metal ions on total iron determination in model wine

2.2 總鐵測定方法的評價

2.2.1標準曲線和方法檢測限

按照改良后的菲洛嗪法，以空白為參比，測定0.25～2.00 mg/L 6個質量濃度梯度的Fe2+標準溶液。以Fe2+質量濃度(mg/L)為橫坐標、562 nm處吸光度為縱坐標，得到總鐵測定的標準曲線為y=0.522 5x-0.022 3，決定系數R2為0.997 9，說明鐵在0.25～2.00 mg/L質量濃度范圍內線性關系良好。

按照美國環保總局計算檢測限的估計方法[25]：配制8份以標準曲線估計的檢測限質量濃度的3倍即0.128 mg/L Fe2+加入空白樣品的Fe2+溶液，以改良菲洛嗪法測定，該方法檢出限的計算公式為

MDL=St(n-1,1-α)

式中S——加標樣品測試結果的標準偏差

t——自由度為n-1時的Student’s值，當n=8時，在99%置信區間(α=0.01)下，t=3.499

n——加標樣品數量，n=8

經計算，檢測限為0.011 5 mg/L。

2.2.2方法的準確度和精密度

以模擬酒、白葡萄酒和紅葡萄酒為實驗酒樣，利用改良菲洛嗪法和原子吸收光譜法分別測定加標(加入Fe2+標準液)前后酒樣中的總鐵濃度，各重復3次，計算方法的回收率。結果如表4所示，改良菲洛嗪法與原子吸收光譜法的測定結果相差很小，并且方法回收率范圍為94.31%～104.34%，說明方法的準確度很好。

表4 葡萄酒樣品中總鐵測定的回收率和方法比較Tab.4 Recovery rates of total iron determination in wine samples and comparison of two methods

選擇0.25、0.50、1.00 mg/L的Fe2+標準溶液和紅、白葡萄酒各1款，利用菲洛嗪法重復測定6次，結果表明，總鐵測定結果的變異系數范圍為0.95%～2.43%，說明方法的精密度良好。

目前，鄰菲啰啉比色法為國標中推薦測定葡萄酒中鐵的方法。然而，該法必須進行酒樣的消化前處理，過程非常繁瑣、耗時。而且，有研究顯示，當水質中總鐵質量濃度低于1 mg/L時，其測定的精密度和準確度較低[26-27]。相比之下，改良菲洛嗪法在測定葡萄酒總鐵含量方面優勢明顯：不僅避免了繁雜的樣品前處理過程，而且準確度和精密度高。

2.3菲洛嗪用量對葡萄酒中Fe2+測定的影響

按照實驗方法，在總鐵為1.0 mg/L(Fe2+與Fe3+摩爾比為4)的模擬酒中，加入不同濃度的菲洛嗪，研究Fe3+共存時菲洛嗪用量對Fe2+測定的影響。

圖4a顯示了不同溶液的吸光度隨反應時間(前10 min)的變化及其多項式擬合曲線(圖中僅列出了摩爾比為7時的擬合曲線方程，A0為曲線截距)。結果表明，隨著菲洛嗪添加量的增加，Fe2+質量濃度所對應的吸光度增大，而R2卻在不斷減小；特別是當摩爾比為8時，曲線的R2已經很差。圖4b為利用外推法獲得的Fe2+質量濃度與實際值(0.8 mg/L，圖4b中的橫向虛線部分)的平均擬合準確度，由結果分析可知，當摩爾比為7時，測定Fe2+濃度與實際值最為接近，擬合準確度為105.87%。而且，該比例下擬合曲線的R2很好(圖4a)，說明菲洛嗪的添加量最為適合。由此可見，在Fe3+共存條件下，存在一個最適合的菲洛嗪用量：過少或過多都會影響對葡萄酒中Fe2+的測定。

圖4 不同菲洛嗪用量對Fe2+測定的影響Fig.4 Effect of ferrozine on Fe2+ determination in model wine

為了確保菲洛嗪用量的準確性和適用性，實驗隨后在含有不同Fe2+與Fe3+摩爾比的模擬酒中(總鐵質量濃度為1.0 mg/L)，加入菲洛嗪(菲洛嗪與總鐵摩爾比為7)，依據Fe2+的測定方法，計算Fe2+質量濃度。結果表明，4階多項式擬合曲線的R2均在0.95以上，擬合的準確度在101.98%～113.50%之間(表5)；這說明：在Fe3+共存條件下，選擇菲洛嗪與總鐵摩爾比為7時，對葡萄酒中Fe2+的測定效果最好。另外，不難發現，隨著Fe2+與Fe3+摩爾比的降低，即Fe3+濃度的增加，擬合曲線的R2在下降，Fe2+的擬合準確度持續偏高(表5)，說明共存Fe3+的濃度越大對Fe2+的測定影響越大，雖然葡萄酒中的鐵主要以Fe2+存在。

因此，Fe3+的存在會影響對葡萄酒中Fe2+的定量測定，影響程度與菲洛嗪用量和Fe3+濃度有關，這與ANASTCIO等[17]的研究結果一致。然而，在葡萄酒條件下，相比于Fe3+濃度的影響，菲洛嗪用量的影響更大。尤其是加入的菲洛嗪過量時，會過高估計葡萄酒中Fe2+的實際濃度(圖4b)。這可能是因為菲洛嗪加入后會優先與酒中的Fe2+絡合，Fe3+/Fe2+氧化還原電勢升高[28]，Fe3+成為較強的氧化劑，在氧化多酚等物質的同時被還原為Fe2+；而過量的菲洛嗪與還原的Fe2+絡合，吸光度增加[7,28]。

表5 Fe3+共存時菲洛嗪法測定的Fe2+質量濃度Tab.5 Concentration of Fe2+ determined by ferrozine assay in model wine containing Fe3+

2.4 樣品測定

利用改良菲洛嗪法測定成品葡萄酒中的總鐵和Fe2+含量。結果顯示，紅葡萄酒中的總鐵質量濃度(平均值3.89 mg/L)明顯高于白葡萄酒中的總鐵質量濃度(平均值1.80 mg/L)(圖5a)，這可能與測試的葡萄酒樣品有關，對此結果仍需擴大酒樣數量進行深入研究；葡萄酒中的鐵以Fe2+為主(圖5b)，紅葡萄酒中的Fe2+百分比(平均值82.15%)高于白葡萄酒中的Fe2+百分比(平均值77.00%)(圖5b)，這與DANILEWICZ[7]的研究結果一致。這可能與紅葡萄酒中含有較豐富的酚類物質有關。

圖5 改良菲洛嗪法測定的葡萄酒中總鐵、Fe2+和Fe3+Fig.5 Determination of total iron, Fe2+ and Fe3+ in wines by the modified ferrozine assay

3 結論

(1)新建立的改良菲洛嗪法，能夠直接、快速測定葡萄酒中的總鐵和Fe2+含量，避免了繁雜的樣品前處理過程及其對Fe2+測定結果準確性的干擾，方法簡單易行、準確度和精密度高，適于在葡萄酒生產中推廣應用。

(2)葡萄酒中共存的Fe3+能夠影響對Fe2+的準確測定，其影響程度主要取決于顯色劑菲洛嗪的用量和Fe3+的濃度，而過量添加菲洛嗪會導致Fe2+測定結果的偏高，適合的顯色劑用量是菲洛嗪與總鐵摩爾比為7。

(3)葡萄酒中的鐵主要以Fe2+形態存在，而與白葡萄酒相比，紅葡萄酒中含有的Fe2+百分比較高。

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RapidDeterminationofTotalIronandFerrousIoninWinebyModifiedFerrozineAssay

GUO Anque ZHANG Xingxing ZHANG Yulin DONG Xin CHEN Liwei

(CollegeofEnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

More and more recent literatures have shown that iron and copper, especially iron plays critical roles in the initiation and propagation of wine oxidation, which seems to depend not only on the total concentration of iron, but also more on the speciation of iron in wine.A rapid method for directly accurate determination of total iron and ferrous ion (Fe2+) in wine was developed by optimizing the ferrozine-based assay for total iron detection, and the effects of ferric ion (Fe3+) and ferrozine levels on the quantification of Fe2+under wine conditions were also investigated.The results showed that the modified ferrozine assay was established for the direct determination of total iron in wine, the standard curve exhibited a good linear relationship between absorbance and iron concentration from 0.25 mg/L to 2.00 mg/L (R2=0.997 9) and the method detection limit was 0.011 5 mg/L, with the recovery rate of 94.31%～104.34%.Moreover, the total iron concentration determined by the modified ferrozine assay was in good accordance with that measured by the atomic absorption spectroscopy (AAS) in different wine samples.However, the presence of Fe3+seriously interfered with the accurate measurement of Fe2+in wine, and the optimized molar ratio of ferrozine to total iron was 7, with fitting accuracy ranging from 101.98% to 113.50% for Fe2+determination.The assay was applied to some commercial bottled wines, and it was confirmed that Fe2+was the dominant iron in wine, although the percentage of Fe2+in red wines was much higher than that in white ones.In brief, the modified ferrozine assay was simple, accurate and reliable to determine total iron and Fe2+in wine rapidly, and it can be widely used in the wine industry in future.

wine; ferrozine assay; total iron; ferrous ion; rapid determination

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.10.043

TS262.6

A

1000-1298(2017)10-0338-07

2017-07-11

2017-08-05

中央高校基本科研業務費專項資金項目(Z109021702)和“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD31B00)

郭安鵲(1976—)，男，講師，博士，主要從事葡萄酒氧化機制研究，E-mail：guoanque@nwsuaf.edu.cn