東北林蛙PDK1基因的克隆及生物信息學分析

鞏珊珊 邵 婕 曲俐俐 柴龍會 張晶鈺 肖向紅

(東北林業大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040)稿件運行過程

東北林蛙PDK1基因的克隆及生物信息學分析

鞏珊珊 邵 婕 曲俐俐 柴龍會 張晶鈺 肖向紅*

(東北林業大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040)稿件運行過程

東北林蛙；PDK1基因；基因克隆；生物信息學分析

PDK1是PI3K/Akt信號通路中的一個重要的激酶。在哺乳動物中，PI3K/Akt信號通路是一條保守的通路，通過激活下游的因子對糖代謝、脂肪代謝以及蛋白質代謝，細胞的增殖、分化、凋亡等起調節控制作用。本研究基于東北林蛙轉錄組數據，從中鑒定出PDK1基因3條Unigene序列，并通過RACE法克隆了PDK1基因的全長cDNA，命名為rdPDK1，其全長為1 990 bp，開放閱讀框長1 674 bp，編碼557個氨基酸。進行生物信息學分析，推測該基因編碼的蛋白質相對分子質量63.7 kD，等電點為7.21。該蛋白第82～344個和443～549個氨基酸是2段保守結構域STKc激酶域和PH調節結構域。同源性分析表明rdPDK1蛋白與HsPDK1蛋白氨基酸序列一致率為79%，相似率為100%；與MmPDK1蛋白氨基酸序列一致率為80%，相似率為100%。本研究結果有望為進一步研究東北林蛙PI3K/Akt信號通路中PDK1基因的特性及功能奠定基礎。

各種生長因子與細胞膜受體結合時，如胰島素，IGF1、PDGF等，與受體相聯系的磷脂酰肌3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)會被激活，內膜脂成分PIP2被PI3K磷酸化轉化成PIP3，PIP3作為第二信使與蛋白的PH(pleckstrin homology)結構域結合控制一系列的信號轉導[1-2]。PDK1((3-phosphoinositide dependent protein kinase1)與PKB(Protein Kinase B or Akt)均具有PH結構域與之結合并被激活。PDK1通過與 PIP3或PIP2結合，招募PKB轉移至細胞膜上，PKB完全活化，激活下游因子，如GSK3β、S6K、叉頭轉錄因子等，從而調節糖、脂肪、蛋白質代謝，細胞增殖分化、生存與凋亡，引起糖原合成、葡萄糖轉運、蛋白合成、細胞生長、擴散和抗凋亡等效應[2-5]。隨著深入的了解，PDK1已被人們廣泛關注，成為研究的熱點。

PDK1是第一個從組織中提取純化的通過PIP3磷酸化PKB活化環(T環，Thr308)的酶[1]。作為AGC蛋白激酶家族中的一員，絲氨酸/蘇氨酸激酶PDK1需要磷酸化Ser241殘基才能被激活，同理與其他AGC家族成員，但其結構和功能卻有所不同[6-7]。在哺乳動物中，PDK1編碼556個氨基酸，分子量約63 kD，是單體多肽酶，擁有2個保守結構域，激酶活化結構域和PH調節結構域，而其他AGC激酶除PKB外均不具PH結構域，且PDK1與PKB的PH結構域位置不同，PDK1的PH結構域位于C末端，而PKB的PH結構域位于N末端的催化結構域中[7]。在PDK1的激酶結構域中還存在一個疏水基團PIF袋，用于調節其他底物，如S6K、RSK、SGK等[8-9]。

在免疫沉淀反應中發現，生長因子或胰島素不能直接激活PDK1，而化學計量法發現，PDK1可以通過分子間作用介導其自身磷酸化。然而只有當存在某些刺激時，PDK1才能完全活化激活下游底物，在無任何刺激時，其活性保持在閾值以下，因其存在的2個結構域：PIF疏水基團和PH結構域，導致了PDK1激活下游底物的機制不一致[6]。因PKB擁有PH結構域，在PIP3存在的情況下，PDK1與PKB的PH結構域結合，從細胞質中轉移至細胞膜，從而在膜上定位，構象發生改變，PDK1迅速磷酸化激活PKB，使之具有活性，發生一系列反應[10-12]。因AGC激酶家族其他成員不具有PH結構域，因此是否存在PIP3對其活化沒有影響，而是通過控制疏水基序磷酸化而促進S6K和SGK活化[3]。

除了PI3K信號通路外，PDK1在很多信號通路中都具有關鍵性作用。其在病理狀態下，會導致Ⅱ型糖尿病及癌癥的發生。在胰島素信號通路中，胰島素傳導受損會造成胰島素抵抗，降低糖耐受，導致Ⅱ型糖尿病。研究發現，特異性PDK1的激動劑可以提高治療糖尿病的效率，同樣特異性PDK1的抑制劑則可大大提高癌癥治療的可能性[3]。因此，人們越來越關注對于PDK1的研究。

東北林蛙(Ranadybowskii)屬于無尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)、林蛙屬，主要分布于中國東北部(黑龍江、吉林、遼寧)、內蒙古、俄羅斯(遠東地區)、蒙古(東部)、日本、韓國及朝鮮半島等地，東北林蛙是一種經濟價值很高的兩棲動物，由其雌性輸卵管干制成的哈士蟆油是我國傳統的中藥材，在市場上供不應求，其作為重要的經濟動物，具有較高的經濟研究價值[13-15]。現如今在世界范圍內兩棲類的數量呈銳減趨勢[16-17]，東北林蛙作為中國東北部的優勢物種同樣面臨瀕臨的危險，給養殖業帶來巨大損失[18-19]。有研究顯示溫度的變化及生態環境的破壞是造成兩棲類數量下降的主要原因之一[15，17]。本實驗室已有研究顯示，在低溫狀態下，東北林蛙體內葡萄糖含量會大量積累，作為抗凍保護物質抵制細胞外液結冰，維持生命[20]。PI3K/PKB信號通路具有多種功能，包括調控細胞生長分化，細胞生存凋亡，糖代謝，脂肪代謝，蛋白質代謝等，且PDK1是PI3K/PKB信號通路中一個關鍵性的激酶[6，21]，也有研究證實，在PDK1缺乏的脂肪細胞中，胰島素誘導激活PKB及S6K的作用被抑制，從而抑制糖原合成及跨膜蛋白葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)的轉位[7]。但其在東北林蛙抵抗溫度變化中的作用未知。

我們根據對東北林蛙皮膚的轉錄組測序克隆了rdPDK1的基因全長，分析其編碼氨基酸結構、信號肽以及功能位點，與其他物種的同源性比較，對其進行進化樹構建。本實驗目的在于揭示rdPDK1的基因功能特性，為更深一步研究奠定基礎，且希望通過對東北林蛙PDK1的研究能為我們針對PI3K信號通路在東北林蛙抗低溫機理的研究提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗的實驗動物為健康的雄性東北林蛙，2～3齡，2015年9月采自于黑龍江省伊春市友好林場，平均體重(20±2)g。首先準備數個通風容器，將東北林蛙低密度放置于通風容器中，4℃通風櫥中培養2～3周后用于實驗，培養期間2 d換1次經活性炭過濾的水，除去容器中水總體積的2/3，保留1/3，其他期間不可隨意移動容器。

1.2 主要試劑

試劑：RNA提取試劑TRIzol?Reagent(Ambion，美國)；PrimeScriptTMRTase、樣品保存液、pMD18-T(TaKaRa，日本)；Biowest Agarose瓊脂糖(Biowest，美國)；rTaqDNA聚合酶、dNTPs、D2 000Mrker、DNA膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)。

1.3 mRNA 序列和引物

東北林蛙的PDK1 mRNA(Messenger RNA)來自于東北林蛙皮膚的基因組序列(數據尚未發表)，the Beijing Genomics Institution(BGI，China)有注釋。引物設計使用軟件Primer Premier 5，用于擴增cDNA片段和末端(RACE法)PCR。

1.4 RNA提取和cDNA合成

取實驗動物東北林蛙雙毀髓處理固定于蛙板上，提取心臟、肝臟、肌肉、腎臟等組織于RNA樣品保存液中，放置于液氮中迅速冷凍，然后轉移至-80℃冰箱中備用。待提取RNA時，將樣品保存液吸出，加入1 mL Trizol試劑，勻漿機勻漿，RNA提取實驗過程按照Trizol試劑說明書進行，最后將獲得的RNA沉淀溶于超純水中，經1%的瓊脂糖凝膠電泳定性檢驗其濃度、純度及其有無蛋白質等雜質，經分光光度計定量檢測其濃度和純度。將RNA溶液保存于-80℃以備后續試驗。按照逆轉錄試劑盒說明書操作步驟進行cDNA合成，取3 μL 總RNA進行反轉錄，cDNA保存于-20℃，用于克隆rdPDK1基因的中間片段。按照RACE法說明書使用P5′RT引物合成cDNA用于5′末端克隆；按照RACE法說明書用3′CDS引物合成cDNA用于3′末端快速擴增。

1.5 東北林蛙PDK1基因中間片段、3′末端、5′末端的克隆

引物設計：基于我們實驗室對東北林蛙皮膚轉錄組進行高通量測序，我們獲得了3條rdPDK1的Unigene序列，分別為Unigene97712(480 bp)、Unigene105918(915 bp)、Unigene100407(556 bp)。通過Unigene序列，我們使用Primer Premier 5軟件對擴增rdPDK1的中間片段進行了特異性引物的上設計，PDK1S和PDK1A。P3′S及RACE法說明書中3′CDS引物用于擴增3′末端，P5′RT、P5′S和P5′A引物用于擴增5′末端(表1)。首先我們進行了最普通的多聚酶鏈式反應，利用特異性引物PDK1S和PDK1A進行中間片段擴增，程序為：94℃變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min30 s，30個循環；72℃延伸2 min，4℃無限循環結束擴增。3′末端擴增：94℃變性2 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環；72℃延伸2 min，4℃無限循環結束擴增。5′末端擴增：首先將cDNA環化，然后將環化cDNA進行PCR，94℃變性2 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min30 s，30個循環；72℃延伸2 min，4℃無限循環，擴增結束。將所有PCR所獲產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，獲取與預測堿基數相近的單一條帶，經DNA膠回收試劑盒回收產物，送生工基因科技股份有限公司進行測序。

1.6 生物信息學分析

東北林蛙PDK1cDNA全長序列被遞交到NCBI，(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)用于獲得可能的開放閱讀框和氨基酸序列；(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)用于蛋白同源序列比對；(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)用于獲得蛋白的保守區域；軟件ExPASy(http：//web.expasy.org/protparam/)用于預測蛋白的理論分子式、分子量、等電點等；跨膜結構通過TMHMM在線服務器(http：//cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)進行預測；Predict Protein(http：//www.predictprotein.org/)用于預測蛋白質的二級結構，使用NetPhos 2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)檢測氨基酸可能的磷酸化位點；軟件Clustalx用于進行各個物種間的氨基酸序列的多重序列比對；軟件MEGA用于進化樹構建；其他物種的氨基酸序列從GenBank中獲得(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)。

2 結果與分析

2.1 東北林蛙PDK1基因的克隆

首先對3條Unigene序列進行BLAST分析，預測已知片段所在位置，經BioEdit分析，發現Unigene105918和Unigene100407為反向互補序列，對Unigene100407進行反向互補得到正義鏈，且與Unigene105918進行拼接。

表1 本實驗所用到的引物

Tab.1 The primers used in the experiment

采用經Prime Primer 5設計的特異性引物(PDK1S、PDK1A)進行多聚酶鏈式反應，擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳獲得與預計分子量大小相符的特異性條帶(圖1a)，經測序獲得578個堿基片段，該片段序列經BioEdit分析與已知Unigene97712的下游和Unigene105918的上游序列都有部分重疊，將其輸入NCBI中進行BLAST，結果顯示其與非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的PDK1的同源性最高，可確定其為同一序列。由特異性引物P3′S利用RACE法進行多聚酶鏈式反應，同樣將產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，獲得與預計分子量大小相符的特異性條帶(圖1b)，經測序獲得290個堿基片段，分析該片段，與Unigene100407下游序列一致。由特異性引物P5′RT、P5′S和P5′A進行PCR擴增，得到與預計大小分子量相符的特異性條帶(圖1c)，克隆后測序得到1條466 bp的片段，該片段序列經序列比對分析與Unigene97712序列一致。

將所得片段與已知Unigene序列拼接后得到PDK1的cDNA全長序列(圖2)，全長共包含1 990 bp，其中開放閱讀框為1 674 bp，編碼557個氨基酸。該序列5′非翻譯區(5′UTR)為90 bp，3′非翻譯區(3′UTR)為226 bp，序列如圖所示依次從左至右排列。

圖1 東北林蛙PDK1基因中間片段(a)、3′端(b)和5′端(c)擴增結果Fig.1 Cloning of PDK1 in Rana dybowskii，Intermediate(a)、3′(b)、5′(c)注：M.D 2 000 DNA 標準Note：D 2 000 DNA Marker

圖2 東北林蛙的PDK1核苷酸序列Fig.2 PDK1 of nucleotide sequence in Rana dybowskii

2.2 東北林蛙PDK1基因的生物信息學分析

2.2.1 東北林蛙PDK1基因編碼氨基酸的一級結構預測分析

利用ExPASy軟件，對rdPDK1基因編碼氨基酸進行預測，結果顯示rdPDK1的分子式為C2858H4438N770O844S20，分子量為63.7 kD，等電點為7.21，親水性為-0.497，證明rdPDK1為親水性蛋白(圖3)，不穩定系數為54.6，說明其為不穩定蛋白。

圖3 東北林蛙PDK1氨基酸親水性/疏水性分析Fig.3 The hydrophilic/ hydrophobic analysis of PDK1 in Rana dybowskii

2.2.2 東北林蛙PDK1蛋白的結構分析

通過NCBI分析東北林蛙PDK1蛋白有2個保守功能區，分別為STKc激酶結構域和PH調節結構域。STKc(a.a.82～344，E=3.38e-171)和PH(a.a.443～549，E=1.16e-67)(圖4)。

圖4 PDK1蛋白的結構域分析圖Fig.4 Protein structure domain distribution of PDK1

2.2.3 東北林蛙PDK1蛋白的二級結構預測

PredictProtein對東北林蛙PDK1氨基酸二級結構的預測呈現結果如下(圖5)，無規則卷曲為該蛋白二級結構中的主要構成部分，約為61.0%，α螺旋和β折疊分別占20.8%和18.1%。其次，軟件TMHMM-2.0結果顯示鏈延伸(Extended strand)范圍內無跨膜結構域的存在。

2.2.4 東北林蛙PDK1蛋白序列與其他物種PDK1蛋白序列多重比對

使用ClustalX軟件對東北林蛙PDK1蛋白的氨基酸序列與HsPDK1(Homospecies)蛋白的氨基酸序列，MmPDK1(Musmouse)進行多重比對，結果如圖6。

圖5 東北林蛙PDK1氨基酸的二級結構預測Fig.5 The secondary structure domain predictionof PDK1 in Rana dybowskii

圖6 東北林蛙與其他物種間PDK1蛋白序列的多重比對Fig.6 Multiple alignment of PDK1 amino sequences and other species 注：東北林蛙(Rd)、人(Hs，AAC51825.1)和鼠(Mm，AAC96115.1)，*表示相同氨基酸 Note：Rana dybowskii(Rd)、Homo sapiens(Hs，AAC51825.1)and Mus musculus(Mm，AAC96115.1)，*and represents the same amino acid

2.2.5 東北林蛙PDK1蛋白磷酸化位點預測

使用NetPhos2.0預測RdPDK1可能的磷酸化位點(表2)，蘇氨酸(Thr)位點13個，絲氨酸(Ser)位點32個，酪氨酸(Tyr)位點9個。

表2 東北林蛙PDK1氨基酸的磷酸位點預測

Tab.2 Prediction of phosphate sites of PDK1 amino acids in Rana dybowskii

2.2.6 東北林蛙PDK1蛋白進化樹構建

使用MEGA5.1軟件對各物種氨基酸序列進行比對構建進化樹，分析各個物種間PDK1蛋白序列的系統發育關系。如圖7所示，東北林蛙與爪蟾(Xenopus)類親緣關系最近，與人(Homosapiens)、黑猩猩(Pantroglodytes)等哺乳動物的親緣關系較遠。

圖7 不同物種的PDK1氨基酸序進化樹構建Fig.7 Phylogenetic relationship of PDK1 proteins in different species 氨基酸序列來源于GenBank，人(Homo sapiens)：AAC51825.1；家鼠(Mus musculus)：AAC96115.1；原雞(Gallus gallus)：NP_001012547.1；褐家鼠(Rattus norvegicus)：NP_112343.1；斑馬魚(Danio rerio)：NP_991262.1；黑猩猩(Pan troglodytes)：JAA29491.1；非洲爪蟾(Xenopus laevis)：XP_018094630.1；熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)：XP_002938460.2；亞洲水牛(Bubalus bubalis)：XP_006059775.1；土撥鼠(Cavia porcellus)：XP_012997135.1；中華鱉(Pelodiscus sinensis)：XP_014429204.1；西洋鮭(Salmo salar)：XP_014014409.1.

3 討論

我們首先利用東北林蛙轉錄組序列獲得了東北林蛙的PDK1全長(rdPDK1)，然后對其序列進行分析。其全長為1 990 bp，開放閱讀框1 674 bp，編碼557個氨基酸，氨基酸結構中存在2個保守結構域，1個是位于第443～549個氨基酸的C末端的PH結構域，1個是位于N末端的第82～344個氨基酸STKc激酶結構域。證實rdPDK1屬于PDK1蛋白家族。

對其進行同源性分析，rdPDK1蛋白與人的PDK1蛋白(Homosapiens，HsPDK1)一致率為100%和79%；與原雞的PDK1蛋白(Gallusgallus，GgPDK1)一致率為99%和81%；與家鼠的PDK1蛋白(Musmusculus，MmPDK1)一致性為100%和80%；與野豬的PDK1蛋白(Susscrofa，SsPDK1)一致性為100%和79%。且在進行多重序列比對時，rdPDK1的氨基酸與人和鼠的PDK1氨基酸一致性極高，證明在進化過程中PDK1蛋白相對保守，并沒有發生過多的突變。使用MEGA5.1軟件進行進化樹構建，發現rdPDK1蛋白與XlPDK1、XtPDK1蛋白親緣關系最近，可見兩棲類動物之間差距較小，與哺乳動物人、黑猩猩等之間的親緣關系相對較遠。

自1997年發現的這個AGC激酶家族的新成員絲氨酸/蘇氨酸激酶PDK1，到目前為止已被公認為是一個PI3K信號通路上的一個重要的關鍵分子，PDK1通過調節各種激酶調控細胞代謝、細胞應答，具有調節細胞生長分化、生存凋亡等功能[21]。在對PDK1的進一步研究過程中發現，PDK1除了可以激活Akt以外，還可以激活PKA、PKC、p70S6-K、RSK、PAK、PRK等23種下游分子；因PDK1擁有自我磷酸化激活功能，可持續擁有活性，從而使底物構象持續發生改變，被磷酸化激活，露出錨定位點，被PDK1捕捉到并與之結合，增強結合能力；作為一種適用于遺傳分析的單拷貝基因，在轉基因小鼠模型中已取得了一定的研究成果[6，22]。由于其重要的地位及在各種疾病中的作用，人們越來越關注對PDK1的研究。本實驗室已經有大量研究顯示，在低溫脅迫下東北林蛙體內葡萄糖濃度會大幅度增長，且冬眠恢復期后生理機能恢復正常，無任何病歷產生，如糖尿病等。PDK1是絲氨酸/蘇氨酸Akt被完全激活的首要分子，以至于控制糖原合成激酶GSK3β及糖原合成酶GS的活性，控制葡萄糖代謝。我們希望可以通過我們的實驗來解析兩棲類冬眠期的生理狀態，為低溫生理學帶來理論數據支持以及可以發現合理的方式來治療諸如糖尿病等疾病。

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Ranadybowskii；PDK1 gene；Gene cloning；Bioinformatics analysis

Cloning and Bioinformatics Analysis of PDK1 Gene in Rana dybowskii

Gong Shanshan Shao Jie Qu Lili Chai Longhui Zhang Jingyu Xiao Xianghong*

(College of Wildlife Resources，Northeast Forestry University，Harbin，150040，China)

PDK1 is an important kinase in the PI3K/Akt signal pathway.The PI3K/Akt signal pathway is a conserved pathway in mammals which，by activating downstream factors，regulates the metabolism of sugar，fat，and protein as well as cell differentiation，proliferation，and apoptosis.In this study，we identified three Unigene sequences of PDK1 gene according to the transcriptome database and cloned the full-length cDNA of PDK1 gene by RACE.The full-length cDNA of PDK1 was named rdPDK1. The full-length cDNA sequence was 1 990 bp and the open reading frame was 1 674 bp，which encoded a protein of 557 amino acids.Bioinformatics analysis showed that the protein encoded by this gene had a relative molecular mass of 63.7 kD and an isoelectric point of 7.21.The amino acids 82 to 344 and 443 to 549 of the protein are two conserved domains STKc and PH，respectively.The identity of RaPDK1 protein with HsPDK1 protein was 79%，and the similarity rate was 100%.The identity of RaPDK1 protein with MmPDK1 protein was 80% and the similarity rate was 100%.The results may provide a basis for the further study of the characterization and function of PDK1 gene inRanadybowskiiPI3K/Akt signal pathway.

2017-03-14

修回日期：2017-05-17

發表日期：2017-11-10

Q959.5

A

2310-1490(2017)04-641-07

國家自然科學基金項目(31672309)

鞏珊珊，女，26歲，碩士研究生；主要從事野生動物生理生態學研究。

*通訊作者：肖向紅，E-mail：xiaoxh2010@sina.com