人參皂苷CK聯合5-氟尿嘧啶對人胰腺癌PANC-1細胞的增殖、凋亡及上皮間質轉化的影響Δ

崔江河，韓光宇，何光梅，尹媛媛，馬娜，劉琳（.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院消化科，黑龍江牡丹江570；2.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院普外科，黑龍江牡丹江570；.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院泌尿外科，黑龍江牡丹江570）

人參皂苷CK聯合5-氟尿嘧啶對人胰腺癌PANC-1細胞的增殖、凋亡及上皮間質轉化的影響Δ

崔江河1＊，韓光宇2#，何光梅3，尹媛媛1，馬娜1，劉琳1（1.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院消化科，黑龍江牡丹江157011；2.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院普外科，黑龍江牡丹江157011；3.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院泌尿外科，黑龍江牡丹江157011）

目的：研究人參皂苷CK聯合5-氟尿嘧啶（5-FU）對人胰腺癌PANC-1細胞的增殖、凋亡及上皮間質轉化（EMT）的影響。方法：將對數生長期的PANC-1細胞分為空白對照組、人參皂苷CK組（30 mg/L）、5-FU組（25 mg/L）和聯用組（人參皂苷CK 30 mg/L+5-FU 25 mg/L）。采用MTT法檢測各組細胞作用24、48、72 h后的細胞增殖抑制率，流式細胞術檢測作用48 h后的細胞凋亡率，酶聯免疫吸附法檢測作用24、48、72、96 h后細胞中纖連蛋白表達，Western blot法檢測作用48 h后細胞中波形蛋白、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、蛋白激酶（Akt）及磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表達。結果：人參皂苷CK、5-FU及其二者聯用對細胞的增殖均有抑制作用；與空白對照組比較，人參皂苷CK組、5-FU組和聯用組各作用時間點的早期和晚期凋亡率、E-鈣黏蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05），纖連蛋白、波形蛋白、N-鈣黏蛋白表達水平和p-Akt/Akt水平均明顯降低（P＜0.05），其中聯用組上述指標效果均優于人參皂苷CK組和5-FU組（P＜0.05）。結論：人參皂苷CK和5-FU均可抑制PANC-1細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制EMT，該作用可能與抑制磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路有關；且二者聯用效果更好。

人參皂苷CK；5-氟尿嘧啶；人胰腺癌PANC-1細胞；聯合給藥；增殖；凋亡；上皮間質轉化

胰腺癌為多發的惡性消化系統腫瘤，發病率呈逐年上升趨勢。由于早期診斷存在困難，多數患者在確診時就已出現周圍器官轉移和侵襲，手術切除率不到30%，5年生存率低于5%[1]。而全身化療能夠根除機體內殘余的腫瘤細胞，從而提高外科手術的治愈率。因此，化療在胰腺癌的治療中占有重要地位。5-氟尿嘧啶（5-FU）是臨床上治療胰腺癌的常用藥物之一，療效確切，但容易引起骨髓抑制、外周神經毒性、口腔黏膜炎等較大的毒副作用，加之耐藥性的出現，限制了其臨床應用范圍的擴大及療效的進一步提高[2]。人參皂苷CK為人參皂苷在生物體內的活性轉化產物，具有抗腫瘤、保肝、提高免疫力、抗炎及降血糖等多種藥理活性[3]。有研究表明，中藥聯合傳統化療藥物能顯著降低化療藥物的毒副反應，提高抗腫瘤療效[4-5]。因此，本研究擬通過人參皂苷CK聯合5-FU，探討聯合用藥對人胰腺癌細胞PANC-1的增殖、凋亡及上皮間質轉化（EMT）的影響，以期為臨床中藥聯合傳統化療藥物治療胰腺癌提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

TDL-50B型離心機（上海安亭科學儀器廠）；MCO-5AC型細胞培養箱（日本Sanyo公司）；550型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；EPICS XL/XL-MCL型流式細胞儀（美國Beckman公司）；DYCZ-24DN型蛋白電泳及轉印儀（北京六一儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷CK（四川維克奇生物科技有限公司，批號：20160128，純度：＞98%）；5-FU注射液（上海旭東海普藥業有限公司，批號：151415，規格：0.25 g∶10 mL）；胎牛血清、RPMI 1640培養基（美國Gibco公司）；MTT檢測試劑盒（美國Amresco公司）；膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（AnnexinⅤ-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；纖連蛋白酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；鼠源波形蛋白、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、蛋白激酶（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；辣根過氧化物酶（HPR）標記的二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 細胞

人胰腺癌PANC-1細胞購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 分組與給藥

將對數生長期的PANC-1細胞分為4組，即空白對照組、人參皂苷CK組（30 mg/L）、5-FU組（25 mg/L）和聯用組（人參皂苷CK 30 mg/L+5-FU 25 mg/L），每組設3個復孔。空白對照組細胞僅加入完全培養基，其余組細胞加入含相應藥物的完全培養基。

2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制率

常規方法培養PANC-1細胞，至對數生長期時，用0.25%的胰蛋白酶消化，制備單細胞懸液，接種于96孔細胞培養板中，每孔1×104個細胞。培養24 h至細胞完全貼壁后，棄培養液，按“2.1”項下分組加入相應完全培養基，孵育24、48、72 h后，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL）溶液，繼續孵育4 h。用酶標儀檢測492 nm波長處光密度（OD），按公式計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率（%）＝（1－OD給藥組/OD空白對照組）×100%。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率

將PANC-1細胞接種于6孔培養板中，每孔1×106個細胞，培養24 h至細胞完全貼壁后，棄培養液，按“2.1”項下分組并加入相應完全培養基，孵育48 h。3 000×g離心10 min，收集細胞并重懸于預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）中；3 000×g離心10 min，加入預冷的75%乙醇，固定30 min；3 000×g離心10 min，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC/PI溶液，在4℃條件下孵育20 min后，補加400 μL PBS溶液。用流式細胞儀檢測并采用Cell Quest軟件分析早期和晚期細胞凋亡情況。

2.4 ELISA法檢測細胞中纖連蛋白表達

將PANC-1細胞接種于6孔培養板中，每孔1×106個細胞，培養24 h至細胞完全貼壁后，棄培養液，按“2.1”項下分組并加入相應完全培養基，分別孵育24、48、72、96 h。收集細胞上清液，按照ELISA檢測試劑盒說明書操作步驟進行裂解、離心，檢測各組細胞中纖連蛋白表達水平。

2.5 Western blot法檢測細胞中波形蛋白、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、Akt和p-Akt蛋白表達

將PANC-1細胞接種于6孔培養板中，每孔1×106個細胞，培養24 h至細胞完全貼壁后，棄培養液，按“2.1”項下分組并加入相應完全培養基，繼續孵育48 h。3 000×g離心10 min，收集細胞，加入細胞裂解緩沖液，劇烈振蕩30 s混勻，于冰上放置30 min；12 000×g離心10 min，取上清液，分裝，存放于－80℃冰箱中，備用。取等量蛋白，常規方法行10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及半干法轉膜后，分別加入適量鼠源波形蛋白、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、Akt、p-Akt和GAPDH多克隆抗體（1∶500），在4℃條件下孵育24 h；加入HPR標記的二抗（1∶2 000），常溫下孵育2 h。增強化學發光法顯色，X線曝光顯影。圖像分析儀掃描后，采用IPP 6.0軟件分析各條帶平均光密度值，蛋白相對表達水平分別以波形蛋白/GAPDH（內參）、N-鈣黏蛋白/GAPDH、E-鈣黏蛋白/GAPDH、p-Akt/Akt的平均光密度比值表示。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 PANC-1細胞增殖抑制率

人參皂苷CK、5-FU及其二者聯用對細胞增殖均有抑制作用。與人參皂苷CK組和5-FU組比較，聯用組細胞作用24、48、72 h后的細胞增殖抑制率均顯著升高（P＜0.05）。各組細胞增殖抑制率的測定結果見表1。

3.2 PANC-1細胞凋亡率

與空白對照組比較，人參皂苷CK組、5-FU組和聯用組細胞作用48 h后早、晚期細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。與人參皂苷CK組和5-FU組比較，聯用組細胞的早、晚期細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。各組細胞凋亡率的流式圖見圖1，測定結果見表2。

表1 各組細胞增殖抑制率的測定結果（±s，n＝3）Tab1 Determination results of cell proliferation inhibition rate in each group（±s，n＝3）

表1 各組細胞增殖抑制率的測定結果（±s，n＝3）Tab1 Determination results of cell proliferation inhibition rate in each group（±s，n＝3）

注：與人參皂苷CK組比較，#P＜0.05；與5-FU組比較，ΔP＜0.05Note：vs.ginsenoside CK group，#P＜0.05；vs.5-FU group，ΔP＜0.05

增殖抑制率，%組別人參皂苷CK組5-FU組聯用組48 h 19.84±2.63 27.13±3.42#49.85±5.61#Δ 24 h 9.75±1.25 17.15±2.13#30.42±4.30#Δ 72 h 22.28±3.09 36.47±4.78#64.88±8.54#Δ

圖1 各組細胞凋亡率的流式圖Fig1 Flow cytometry chart of cell apoptosis rate in each group

表2 各組細胞凋亡率的測定結果（±s，n＝3）Tab2 Determination results of cell apoptosis rate in each group（±s，n＝3）

表2 各組細胞凋亡率的測定結果（±s，n＝3）Tab2 Determination results of cell apoptosis rate in each group（±s，n＝3）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與人參皂苷CK組比較，#P＜0.05；與5-FU組比較，ΔP＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.ginsenoside CK group，#P＜0.05；vs.5-FU group，ΔP＜0.05

晚期2.39±0.25 7.28±1.57＊9.34±1.32＊#15.06±2.40＊#Δ組別空白對照組人參皂苷CK組5-FU組聯用組細胞凋亡率，%早期3.22±0.47 15.51±2.34＊19.62±3.68＊#41.19±6.64＊#Δ

3.3 PANC-1細胞中纖連蛋白表達水平

與空白對照組比較，人參皂苷CK組、5-FU組和聯用組細胞作用24、48、72、96 h后細胞中纖連蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），且隨著作用時間的增加，表達水平逐漸降低。與人參皂苷CK組和5-FU組比較，聯用組細胞作用24、48、72、96 h后細胞中纖連蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。各組細胞中纖連蛋白表達的測定結果見表3。

表3 各組細胞中纖連蛋白表達的測定結果（±s，n＝3）Tab3 Determination results of fibronectin expression in cells in each group（±s，n＝3）

表3 各組細胞中纖連蛋白表達的測定結果（±s，n＝3）Tab3 Determination results of fibronectin expression in cells in each group（±s，n＝3）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與人參皂苷CK組比較，#P＜0.05；與5-FU組比較，ΔP＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.ginsenoside CK group，#P＜0.05；vs.5-FU group，ΔP＜0.05

組別空白對照組人參皂苷CK組5-FU組聯用組纖連蛋白，ng/mL 96 h 68.76±8.21 48.84±5.29＊35.21±3.18＊#28.66±4.34＊#Δ 24 h 74.50±8.33 66.64±8.34＊63.58±7.05＊52.82±7.80＊#Δ 48 h 69.25±7.59 60.02±6.12＊52.92±6.11＊#43.40±5.53＊#Δ 72 h 70.38±8.96 54.07±6.24＊45.49±6.06＊#32.48±4.13＊#Δ

3.4 PANC-1細胞中波形蛋白、N-鈣黏蛋白及E-鈣黏蛋白表達水平

與空白對照組比較，人參皂苷CK組、5-FU組和聯用組細胞作用48 h后細胞中波形蛋白、N-鈣黏蛋白表達水平均顯著降低，E-鈣黏蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。與人參皂苷CK組和5-FU組比較，聯用組細胞作用48 h后細胞中波形蛋白、N-鈣黏蛋白表達水平顯著降低，E-鈣黏蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。各組細胞中波形蛋白、N-鈣黏蛋白及E-鈣黏蛋白表達的電泳圖見圖2，測定結果見表4。

圖2 各組細胞中波形蛋白、N-鈣黏蛋白及E-鈣黏蛋白表達的電泳圖Fig2 Electrophoresis charts of expressions of vimentin，N-cadherin and E-cadherin in cells in each group

表4 各組細胞中波形蛋白、N-鈣黏蛋白及E-鈣黏蛋白表達的測定結果（±s，n＝3）Tab4 Determination results of expressions of vimentin，N-cadherin and E-cadherin in cells in each group（±s，n＝3）

表4 各組細胞中波形蛋白、N-鈣黏蛋白及E-鈣黏蛋白表達的測定結果（±s，n＝3）Tab4 Determination results of expressions of vimentin，N-cadherin and E-cadherin in cells in each group（±s，n＝3）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與人參皂苷CK組比較，#P＜0.05；與5-FU組比較，ΔP＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.ginsenoside CK group，#P＜0.05；vs.5-FU group，ΔP＜0.05

E-鈣黏蛋白/GAPDH 0.22±0.04 0.30±0.05＊0.35±0.06＊#0.43±0.06＊#Δ組別空白對照組人參皂苷CK組5-FU組聯用組波形蛋白/GAPDH 0.45±0.06 0.33±0.04＊0.26±0.04＊#0.21±0.03＊#Δ N-鈣黏蛋白/GAPDH 0.62±0.08 0.51±0.06＊0.38±0.05＊#0.29±0.05＊#Δ

3.5 PANC-1細胞中Akt、p-Akt蛋白表達

空白對照組、人參皂苷CK組、5-FU組和聯用組細胞作用48 h后細胞中p-Akt/Akt分別為0.45±0.06、0.27±0.02、0.25±0.02、0.18±0.01。與空白對照組比較，人參皂苷CK組、5-FU組和聯用組細胞中p-Akt/Akt均顯著降低（P＜0.05）。與人參皂苷CK組和5-FU組比較，聯用組細胞中p-Akt/Akt顯著降低（P＜0.05）。各組細胞中Akt、p-Akt蛋白表達的電泳圖見圖3。

4 討論

人參皂苷是人參的主要活性成分，目前已分離、鑒定出40余種單體化合物，而人參皂苷CK為二醇型皂苷，是其他類型的二醇型人參皂苷在腸道內的活性代謝產物，在天然人參中并不存在。研究表明，人參的許多生物活性都與人參皂苷CK有關，如人參皂苷Rb1在腸道中很少被吸收，只是以“天然活性前體”形式存在，而人參皂苷CK才是被吸收和發揮生物學作用的真正活性物質[6]。與其他人參皂苷單體比較，人參皂苷CK的抗腫瘤活性和增強免疫活性是最強的，且由于其具有較好的水溶性，可以直接制成注射劑發揮作用，因此得到了研究者越來越多的關注[7]。人參皂苷CK的抗腫瘤作用報道較多，其對膀胱癌、鼻咽癌、肝細胞癌、乳腺癌及結腸癌等均具有一定的抑制作用，而對胰腺癌的抑制作用及與現有化療藥物聯用的相關研究較少[8]。本研究發現，與空白對照組比較，人參皂苷CK組、5-FU組和聯用組的細胞增殖抑制率均顯著升高，且聯用組高于人參皂苷CK組和5-FU組。有研究發現，人參皂苷CK可以通過降低線粒體跨膜電位、增加細胞色素C釋放、激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）等途徑，誘導前列腺癌PC-3細胞及人白血病HL-60細胞發生凋亡[9]。由此可見，人參皂苷CK的抗腫瘤作用主要是通過誘導腫瘤細胞凋亡而實現的。本研究結果表明，與空白對照組比較，人參皂苷CK組、5-FU組和聯用組PANC-1細胞的早、晚期凋亡率均顯著升高，且聯用組高于人參皂苷CK組和5-FU組。以上結果表明，人參皂苷CK、5-FU均具有抑制PANC-1細胞增殖及誘導凋亡作用，而聯用的效果強于單用。

EMT是以上皮細胞特性喪失及間質細胞特性獲得為特征，是腫瘤細胞發生侵襲及轉移的重要依據。纖連蛋白是參與細胞和基質以及細胞與細胞之間黏附、遷移的細胞外基質糖蛋白。在EMT進程中，纖連蛋白表達明顯升高[10]。本研究發現，與空白對照組比較，人參皂苷CK組、5-FU組和聯用組的PANC-1細胞中纖連蛋白表達水平均顯著降低，且聯用組低于人參皂苷CK組和5-FU組。波形蛋白、N-鈣黏蛋白和E-鈣黏蛋白是EMT進程的重要標志性分子，在EMT進程中，波形蛋白、N-鈣黏蛋白表達增加，E-鈣黏蛋白表達降低[11]。本研究進一步發現，與空白對照組比較，人參皂苷CK組、5-FU組和聯用組PANC-1細胞中波形蛋白及N-鈣黏蛋白表達水平均顯著降低，而E-鈣黏蛋白表達水平顯著升高，且聯用組效果較人參皂苷CK組和5-FU組更明顯。以上結果表明，人參皂苷CK和5-FU均具有抑制EMT的作用，總體上兩者聯用效果強于單用。

在腫瘤細胞的增殖與凋亡過程中，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信號通路扮演著重要角色，多數腫瘤細胞中的PI3K/Akt信號通路處于活化狀態[12]。PI3K可促使Akt發生磷酸化，當PI3K/Akt信號通路處于活化狀態時，Akt的磷酸化形式p-Akt的比例升高，反之降低。多種化療藥物均可以通過阻斷PI3K/Akt信號通路而發揮抗腫瘤作用[13]。此外，PI3K/Akt信號通路的激活可以促進EMT的發生。研究證實，抑制PI3K/Akt信號通路的激活可以抑制乳腺癌MCF-7細胞和BT-20細胞的EMT進程[14-15]。本研究發現，與空白對照組比較，人參皂苷CK組、5-FU組和聯用組細胞中p-Akt/Akt均顯著降低，且聯用組低于人參皂苷CK組和5-FU組。以上結果提示，抑制PANC-1細胞的PI3K/Akt信號通路活化可能是人參皂苷CK、5-FU及二者聯合給藥發揮抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡及抑制EMT進程的潛在機制之一。

綜上所述，人參皂苷CK和5-FU對人胰腺癌PANC-1細胞均具有抑制增殖、誘導凋亡及抑制EMT的作用，該作用可能與抑制PI3K/Akt信號通路活化有關，且兩者聯用時效果更好。

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Effects of Ginsenoside CK Combined with 5-Fluorouracil on the Proliferation，Apoptosis and Epithelial Mesenchymal Transition of Human Pancreatic Cancer PANC-1 Cells

CUI Jianghe1，HAN Guangyu2，HE Guangmei3，YIN Yuanyuan1，MA Na1，LIU Lin1（1.Dept.of Gastroenterology，Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University，Heilongjiang Mudanjiang 157011，China；2.Dept.of General Surgery，Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University，Heilongjiang Mudanjiang 157011，China；3.Dept.of Urology Surgery，Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University，Heilongjiang Mudanjiang 157011，China）

OBJECTIVE：To study the effects of ginsenoside CK combined with 5-fluorouracil（5-FU）on the proliferation，apoptosis and epithelial mesenchymal transition（EMT）of human pancreatic cancer PANC-1 cells.METHODS：PANC-1 cells of logarithmic growth phase were randomly divided into blank control group，ginsenoside CK group（30 mg/L），5-FU group（25mg/L）and combination group（ginsenoside CK 30 mg/L+5-FU 25 mg/L）.MTT method was used to detect the cell proliferation inhibition rate in each group after 24，48，72 h；flow cytometry was used to detect the cell apoptosis rate after 48 h；enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the fibronectin expression in cells after 24，48，72，96 h；and Western blot was used to detect the expressions of vimentin，N-cadherin，E-cadherin，protein kinase（Akt）and phosphorylated Akt（p-Akt）protein in cells after 48 h.RESULTS：Compared with blank control group，the cell proliferation inhibition rate，early and late apoptotic rates，protein expression level of E-cadherin in ginsenoside CK group，5-FU group and combination group were obviously increased（P＜0.05），while the protein expression levels of fibronectin，vimentin，N-cadherin，and p-Akt/Akt levels were obviously decreased（P＜0.05）；the effects of above-mentioned indexes in combination group were superior to ginsenoside CK group and 5-FU group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Both ginsenoside CK and 5-FU can inhibit the proliferation of PANC-1 cells，induce their apoptosis and inhibit EMT，which may be associated with inhibiting phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway.In addition，the combination of ginsenoside CK and 5-FU can produce a better effect.

Ginsenoside CK；5-fluorouracil；Human pancreatic cancer PANC-1 cells；Combined administration；Proliferation；Apoptosis；Epithelial mesenchymal transition

R361+.3

A

1001-0408（2017）31-4388-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.18

牡丹江市科學技術計劃項目（No.Z2015s0055）

＊主治醫師。研究方向：消化系統疾病的診斷及治療。電話：0453-6582800。E-mail：18215039@qq.com

#通信作者：主治醫師。研究方向：普外科臨床與科研。電話：0453-6582800。E-mail：hanguangyu1981@163.com

2017-03-06

2017-06-09）

（編輯：鄒麗娟）