不同產地淡豆豉優勢發酵菌群的篩選及酶活性分析Δ

陳麗艷，劉青，孫銀玲，王萍，張蕾，王偉明（黑龍江省中醫藥科學院，哈爾濱150036）

不同產地淡豆豉優勢發酵菌群的篩選及酶活性分析Δ

陳麗艷＊，劉青，孫銀玲，王萍，張蕾，王偉明#（黑龍江省中醫藥科學院，哈爾濱150036）

目的：為淡豆豉生產標準化提供參考。方法：分別采集黑龍江、河北、甘肅、山東、安徽、云南等6個產地的淡豆豉，以青蒿、桑葉選擇性培養基培養發酵菌，分別采用福林酚法、纖維蛋白平板法、對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷顯色法測定菌株的蛋白酶、纖溶酶、β-葡萄糖苷酶活性以篩選發酵優勢菌。結果：從6個產地淡豆豉中共分離出14個野生型菌株，包括3株細菌和11株霉菌。其中，從黑龍江產淡豆豉中分離出桿狀細菌1株和毛霉菌1株；從河北產淡豆豉中分離出毛霉菌2株和桿狀細菌1株；從甘肅產淡豆豉中分離出毛霉菌1株、青霉菌1株、微球菌1株、曲霉菌1株；從山東產淡豆豉中分離出毛霉菌2株；從安徽產淡豆豉中分離出毛霉菌1株和曲霉菌1株；從云南產淡豆豉中僅分離出毛霉菌1株。根據菌種類別及酶活性測定結果分析，初步判定其中的1號桿狀細菌、9號曲霉菌、11號和14號毛霉菌為優勢發酵菌，4種菌的3種酶總活性分別為22.77、25.49、41.32、39.13 U/g。結論：不同產地淡豆豉中發酵菌有所不同，通過酶活性分析可初步篩選出優勢發酵菌。

淡豆豉；產地；選擇性培養基；優勢菌；酶活性

淡豆豉飲片為豆科植物大豆[Glycine max（L.）Merr.]的成熟種子的發酵加工品，具有解表、除煩、宣發郁熱等功效[1-2]，從1963年版《中國藥典》（一部）開始一直到2015年版均有記載。從古至今，淡豆豉的生產一直采用傳統自然發酵工藝，參與發酵的菌種不明確，且菌種隨環境的變化而不同，因此造成不同產地、不同批次的產品質量差異較大，阻礙了淡豆豉生產工藝標準化進程，進而直接影響了其臨床用藥的安全性和有效性。淡豆豉質量標準化關鍵在于發酵菌種標準化，因此篩選優勢發酵菌種極為重要。

豆豉、淡豆豉發酵菌群的培養通常采用常規培養基[3-4]，培養出的微生物種類較多。淡豆豉為青蒿、桑葉的煎煮液浸泡大豆后經自然發酵而得，而常規培養基與淡豆豉基質成分存在明顯差異，對于淡豆豉的菌種分離不具更好的適應性和選擇性，使菌種的篩選過程煩瑣、耗時長。作者前期研究已建立了用含有青蒿、桑葉煎煮液的選擇性培養基分離培養淡豆豉發酵優勢菌的方法[5]，此方法可快速、準確地篩選淡豆豉優勢菌。另外，發酵過程中微生物會產生豐富的酶：蛋白酶可將大豆蛋白水解成小分子肽類和游離氨基酸[6]；β-葡萄糖苷酶能催化水解烴基與糖基的糖苷鍵，將大豆中的苷類降解為苷元，更利于人體吸收[7]；纖溶酶是豆豉發酵過程中微生物產生的具有溶栓作用的活性物質[8]。這3種酶的活性高低均會影響淡豆豉的功效。

本研究通過青蒿、桑葉選擇性培養基分離培養不同產地淡豆豉飲片的發酵菌群，并通過蛋白酶、β-葡萄糖苷酶及纖溶酶的活性測定初步篩選發酵優勢菌，為淡豆豉生產和質量標準化提供依據。

1 材料

1.1 儀器

DL-CJ-2N凈化工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；BSA224S電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；MF3多功能一體機（杭州迅數科技有限公司）；DHP-9272恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；WH-2微型渦旋混合儀（北京京立離心機有限公司）；Legend Micro 17R冷凍高速離心機[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；M2000多功能酶標儀[帝肯（上海）貿易有限公司]；400C離心機（北京白洋離心機有限公司）。

1.2 藥材

桑葉、青蒿購自河北祁新中藥顆粒飲片有限公司，經黑龍江省中醫藥科學院王偉明研究員鑒定分別為桑科植物桑（Morus alba L.）的葉和菊科植物黃花蒿（Artemisia annua L.）的干燥地上部分。根據我國淡豆豉生產企業所處的地理位置及生產環境共采集6個具有代表性的產地的淡豆豉飲片進行分析，詳細信息見表1。

表1 6個產地淡豆豉飲片信息Tab1 Information of Sojae semen praeparatum from 6 production places

1.3 試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA，批號：20150916）、瓊脂粉（批號：20150606）均購自北京奧博星生物技術有限責任公司；尿激酶標準品（批號：140604-201224）、纖維蛋白原（批號：140626-201611）、凝血酶原（批號：20130306）均購于中國食品藥品檢定研究院；對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（PNPG）、酪氨酸、對硝基苯酚均為分析純。

2 方法

2.1 樣品的處理及發酵菌培養

參照作者前期研究方法[5]制備選擇性培養基及菌液樣品。采用平板稀釋法將不同濃度菌液接種至鋪有選擇性培養基的平皿上，于（28±2）℃恒溫培養2～6 d，觀察并記錄菌落生長情況。

2.2 菌種的初步鑒定

將分離菌種純化后用試管馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基培養并于4℃保存。通過菌落形態及顯微特征并參照《伯杰細菌鑒定手冊》[9]和《真菌鑒定手冊》[10]對菌種進行初步鑒定。然后對細菌進行革蘭氏染色，對霉菌采用扦片法培養后進行顯微觀察。

2.3 酶活性測定

經“2.1”“2.2”項下方法得到的菌株進行酶活性測定，以篩選優勢發酵菌群。分別采用福林酚法測定蛋白酶活性[11]，PNPG顯色法測定β-葡萄糖苷酶活性[12]，纖維蛋白平板法測定纖溶酶活性[13]。

3 結果

3.1 不同產地淡豆豉發酵菌群分離結果

不同產地淡豆豉發酵菌的種類及數量見表2。

表2 不同產地淡豆豉發酵菌的種類及數量Tab2 Species and quantities of fermentive bacteria in Sojae semen praeparatum decoction pieces from different production places

由表2可見，從6個產地淡豆豉中共分離出14株野生型菌株，經初步鑒定，其中細菌3株（桿狀細菌2株、微球菌1株）、霉菌11株（其中毛霉菌8株、曲霉菌2株、青霉菌1株）?？梢?，不同產地淡豆豉中發酵菌有所不同，其中從CD1淡豆豉中篩選出桿狀細菌1株和毛霉菌1株；從CD2淡豆豉中篩選出毛霉菌2株和桿狀細菌1株；從CD3淡豆豉中篩選出毛霉菌1株、青霉菌1株、微球菌1株、曲霉菌1株；從CD4淡豆豉中篩選出毛霉菌2株；從CD5淡豆豉中篩選出毛霉菌1株和曲霉菌1株；從CD6淡豆豉中僅分離出毛霉菌1株。

3.2 酶活性測定結果

不同產地淡豆豉發酵菌的酶活性見圖1。

由圖1可見，其中1、11、14號菌的纖溶酶活性較高，2、7、10號菌的β-葡萄糖苷酶活性較高，9、11、14號菌的蛋白酶活性較高，而4、10、13號菌的蛋白酶活性處于較低水平。1、9、11、14號菌的酶活性綜合水平較高，3種酶總活性分別為22.77、25.49、41.32、39.13 U/g，初步確定為優勢發酵菌群。

圖1 不同產地淡豆豉發酵菌的酶活性比較Fig1 Comparison of enzyme activities of fermentive bacteria in Sojae semen praeparatum from different production places

3.3 優勢發酵菌的顯微形態觀察結果

淡豆豉優勢發酵菌群的顯微特征觀察結果見圖2。

圖2 淡豆豉優勢發酵菌的顯微特征Fig2 Microscopic features of dominant fermentive bacteria in Sojae semen praeparatum

結合菌落形態并根據《伯杰細菌鑒定手冊》[9]和《真菌鑒定手冊》[10]，可初步判定1號菌為桿狀細菌，9號菌為曲霉菌，11、14號菌均為毛霉菌，但顯微形態仍有差異，可能為同屬不同種，但分離的菌株仍需進一步鑒定。

4 討論

淡豆豉為自然條件下多菌種混合發酵而成，因地區、季節及生產環境不同菌群會發生變化，而淡豆豉質量、風味、功效也會隨菌群變化而存在差異。本研究對6個不同產地淡豆豉樣品進行菌群種類、數量及酶活性分析，結果表明，不同產地淡豆豉的微生物群系及主要發酵菌存在明顯不同，通過酶活性分析可初步確認優勢發酵菌。

與文獻[14]報道的不同產地淡豆豉發酵菌的研究比較，本研究應用青蒿、桑葉選擇性培養基是以2015年版《中國藥典》（一部）中淡豆豉飲片的炮制工藝為基礎，模擬淡豆豉發酵環境并經實驗驗證該培養基可選擇性抑制有害菌、保留發酵優勢菌，分離篩選出的菌種種類較少，使菌種篩選更加簡便、快捷。鑒于飲片在干燥、存貯、運輸及銷售過程中難免發生二次污染，因此在制備菌液時，需用無菌生理鹽水多次洗滌淡豆豉飲片以盡可能減少外界雜菌干擾，使發酵優勢菌更具代表性。淡豆豉為自然條件下多菌種混合發酵而成，通過酶活性分析篩選出發酵優勢菌?？筛鶕煌拿笇W特性重新組合發酵菌種，再進一步考察其發酵工藝及異黃酮類等功效成分變化，為淡豆豉發酵菌種標準化提供依據。

綜上所述，本研究所獲得的優勢菌均為自然界野生型菌株，通常作為始發菌，再經人工選育，即以功效產物為靶標，采用定向誘變等遺傳育種技術才能獲得更高活性的生產用菌株。此外，還需進行傳統發酵工藝向現代發酵工藝的轉變，為優良菌種提供最佳發酵環境條件，從而獲得功效穩定、安全可控的淡豆豉產品，實現真正意義上的淡豆豉生產標準化。

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Screening and Enzymatic Activity Analysis of Dominant Fermentive Bacteria of Sojae Semen Praeparatum from Different Production Places

CHEN Liyan，LIU Qing，SUN Yinling，WANG Ping，ZHANG Lei，WANG Weiming（Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150036，China）

OBJECTIVE：To provide reference for the standardized production of Sojae semen praeparatum（SSP）.METHODS：SSP samples from Heilongjiang，Hebei，Gansu，Shandong，Anhui and Yunnan were respectively collected.The fermentive bacteria were cultured with the selective medium contained artemisiae annuae herba and mori folium.Foline-phenol method，fibrous protein plate method and p-nitrophenol-β-D-glucoside colorimetric method were respectively conducted to determine the activities of protease，plasmin and β-glucosidase of the strains to screen dominant fermentive bacteria.RESULTS：Totally 14 wild strains were separated from SSP samples from 6 production places，including 3 strains of bacteria and 11 strains of molds.1 strain of rod-shaped bacteria and 1 strain of Mucor sp.were separated from SSP from Heilongjiang；2 strains of Mucor sp.and 1 strain of rod-shaped bacteria were separated from SSP from Hebei；1 strain of Mucor sp.，1 strain of Penicillium sp.，1 strain of Streptococcus sp.and 1 strain of Aspergillus sp.were separated from SSP from Gansu；2 strains of Mucor sp.were separated from SSP from Shandong；1 strain of Mucor sp.and 1 strain of Aspergillus sp.were separated from SSP from Anhui；and only 1 strain of Mucor sp.was separated from SSP from Yunnan.According to the strains category and enzyme activities，No.1 bacillus，No.9 Aspergillus sp.，No.11 and No.14 Mucor sp.were preliminary authenticated as dominant fermentation microorganism，total enzyme activities of the 4 strains were 22.77，25.49，41.32，39.13 U/g respectively.CONCLUSIONS：The fermentive bacteria of SSP from different production places were different，and the dominant one can be screened preliminary through enzyme activity analysis.

Sojae semen praeparatum；Production place；Selective medium；Dominant bacteria；Enzyme activity

R932

A

1001-0408（2017）31-4359-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.10

國家中醫藥管理局公益性行業科研專項經費項目（No.201507004-03）；黑龍江省應用技術研究與開發計劃新創辦企業項目（No.PB15F005）

＊主任藥師，碩士。研究方向：發酵類中藥的研究。電話：0451-55653086-6845。E-mail：cly9998@163.com

#通信作者：研究員，博士。研究方向：中藥新藥開發及中藥資源研究。電話：0451-55665478。E-mail：1442540238@qq.com

2017-02-15

2017-05-10）

（編輯：余慶華）