妊娠晚期3種自體血貯存方法對紅細胞凝集狀態的影響

丁杰鋒 陳海江 桑列勇 吳云路 楊旦

妊娠晚期3種自體血貯存方法對紅細胞凝集狀態的影響

丁杰鋒 陳海江 桑列勇 吳云路 楊旦

目的通過對紅細胞凝集狀態作鏡下直觀比較，探究妊娠晚期3種自體血貯存方案的優劣，為臨床更好的開展貯存式自體輸血提供依據。方法選擇2011年1月至2014年6月有自體輸血指征的106例孕婦，按照貯存方案不同，將自體血分成標準抗凝組（30例）、擴大抗凝組（25例）、自體成分組（51例），采用并行留樣，于10×50倍鏡下觀察紅細胞聚集狀態，觀察時間點設為：24h，第7、14、21天。每組每個時間點觀察200個紅細胞，并計數其中游離紅細胞的數目。結果標準抗凝組：保存至第3天紅細胞就出現線串樣凝集，游離紅細胞數目急劇下降；擴大抗凝組：保存至第7天紅細胞發生線串樣凝集，第14天時游離紅細胞數量急劇地下降；自體成分組：24h至第21天，不同時間點幾乎所有紅細胞均呈游離狀態。結論在妊娠晚期行自體貯血，標準比例抗凝方案已經不可取；擴大抗凝方案可以延緩血液凝集，但血液保存超過7d，不推薦臨床使用；而對自體血進行成分分離后保存，可以長時間保持紅細胞的游離狀態，是一種值得推廣的新方案。

妊娠晚期自體輸血標準抗凝擴大抗凝自體成分血

近年來，貯存式自體輸血（preoperative autologous blood donation，PABD）以其獨特的優勢在婦產科領域中被廣泛應用[1-3]，尤其是在產科，因為平產或剖腹產手術時間可以預知，產前經過充分的檢查診斷，產科醫生對患者是否出血和出血量有一定的估計；同時，對一些稀有血型和不規則抗體陽性的孕婦，選擇PABD更能為安全分娩提供保障。產科自體輸血的血液采集時間一般為產前15～25d，此時已屬于妊娠晚期階段，這一階段孕婦的血液處于高凝狀態，原因如下：（1）隨著孕周的增加，血液中纖維蛋白原（FIB）水平逐漸升高，同時凝血因子增加，使得血液日趨呈高凝狀態[4]，加之產科自體血貯存時間較長，較高水平FIB與凝血因子容易發生凝血反應而形成小凝塊。（2）高水平FIB改變了紅細胞表面的負電荷，使負電荷降低，拉近了紅細胞間的距離；同時FIB易在血液中形成網絡，具有橋聯力作用[5]，可使紅細胞柔順性受損、可塑變形能力大大降低，易于聚集。基于此，我們提出以下假設：（1）由于血液處于高凝狀態，欲行自體輸血的妊娠晚期孕婦，在血液貯存時采用標準比例抗凝劑抗凝，可能不會收到良好的抗凝效果，而血漿中FIB和紅細胞的共同作用將進一步增加此階段血液的易凝固性；（2）擴大抗凝比例可以提高妊娠晚期自體血貯存效果；（3）將妊娠晚期自體血進行成分分離后保存，可以提高妊娠晚期自體血貯存效果。為了驗證以上假設，筆者設計了3種不同的妊娠晚期血液保存方案，并通過對紅細胞凝集狀態作鏡下直觀比較，探究3種方案的優劣，為臨床更好的開展PABD提供依據。

（正文見第1771 頁）

圖1 標準抗凝組鏡下觀察結果（a:0h；b:24h；c:第3天；d:第7天；e:第14天；f:第21天；10×50）

圖2 擴大抗凝組鏡下觀察結果（a:24h；b:第7天；c:第14天；d:第21天；10×50）

圖3 自體成分組鏡下觀察結果（a:24h；b:第7天；c:第14天；d:第21天；10×50）

1 資料和方法

1.1 一般資料選擇2011年1月至2014年6月有自體輸血指征的妊娠晚期孕婦106例，年齡22～35（26.50±3.45）歲；體重47～78kg，中位數61kg。自體采血指征：排除心血管系統疾病、糖尿病、妊娠期高血壓疾病、感染性疾病、內科合并癥之后，要求無產兆、病情穩定無陰道出血，胎兒無生長受限和宮內缺氧的表現；同時需滿足Hb＞105g/L，Plt＞100×109/L。符合以上條件者實施PABD，采血時機于手術前15～25d，所有自體輸血患者采血前均簽署自體輸血知情同意書。

1.2 材料與器材自體采血血袋（長春泰爾茂，血袋批號：20120612、20130226，300、400ml血袋內分別含紅細胞保養液42、56ml）；顯微鏡成像系統（奧林巴斯CX31）；載玻片、蓋玻片（上海機械進出口集團公司）；血液離心機（美國貝克曼公司）。

1.3 貯存方案和分組根據不同的貯存方案進行分組，貯存方案一：標準抗凝組30例，用正常抗凝劑容量的血袋采集自體血，即用300ml血袋采集300ml自體血；采用CPDA全血保養液抗凝，采血后混勻并儲存于（4±2）℃儲血冰箱。貯存方案二：擴大抗凝組25例，采用增加抗凝劑容量的血袋采集自體血，即用300ml血袋采集200ml自體血；采血后混勻并儲存于（4±2）℃儲血冰箱。貯存方案三：自體成分組51例，用正常抗凝劑容量的血袋采集自體血，即用300ml血袋采集300ml自體血，并將自體血在6h內分離制備成懸浮紅細胞和新鮮冰凍血漿，全程保證在冷鏈狀態。

1.4 方法

1.4.1 成分血制備離心前進行血袋檢查：檢查多聯袋有無破損、標簽是否齊全、一致。將準備進行離心的全血配平前在電腦上進行離心機的使用登記，登記內容涉及血液品種、獻血編號、離心機機號、離心日期、時間、轉速、溫度等重要信息。配平離心：將登記后的全血放于離心機專用套筒中，然后用血液配平儀進行配平，配平后，放入離心機中進行離心。離心參數：離心溫度2～6℃，離心速度5 000g，離心時間10min。觀察離心完畢的全血分層是否清晰及血袋外觀是否正常等信息后在低溫操作臺上使用血漿擠壓器將上層血漿分離至空轉移袋（制備血漿用）。并將另一轉移袋內紅細胞添加液加入紅細胞內，將保養液與紅細胞充分搖勻，即成紅細胞懸液。熱合封口、檢查熱合點是否密閉，檢查母袋與轉移袋的獻血編號是否一致，此過程注意觀察紅細胞內有無凝塊、破損等異常情況。

1.4.2 形態學觀察3組自體血均采用并行留樣，于10×50倍下觀察紅細胞聚集狀態，觀察時間點設為：24h、第7、14、21天。對于標準抗凝組，增加0h及第3d兩個時間點。凝集紅細胞團判斷標準：3個及3個紅細胞凝集在一起判斷為一個凝集紅細胞團。每組每個時間點觀察200個紅細胞，并計數其中游離紅細胞的數目，鏡下拍照記錄。

1.5 統計學處理應用SPSS 19.0統計軟件，計量資料用表示，組間比較采用單因素方差檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標準抗凝組鏡下情況觀察血液標準抗凝后，0h觀察顯示紅細胞幾乎均呈游離狀態，24h后紅細胞出現2～3個細胞凝集，在鏡下滴加0.9%氯化鈉溶液，紅細胞恢復正常形態；保存第3天的全血中紅細胞在短時間內發生線串樣凝集。在鏡下滴加0.9%氯化鈉溶液紅細胞恢復正常形態；第7天時紅細胞呈緊密線串樣并輕微變形，在鏡下滴加0.9%氯化鈉溶液紅細胞未恢復散開形態；保存至第14天時，線串樣凝集逐漸緊密，同時可見纖維蛋白絲析出在紅細胞團周圍，并出現團狀黏液結構。保存至第21天時，出現黏液結構并呈團狀，紅細胞連接成網狀結構并部分溶血（見圖1，插頁）。

2.2 擴大抗凝組鏡下情況觀察采集后24h紅細胞幾乎未出現細胞凝集；保存第7天的全血中紅細胞在短時間內發生線串樣凝集，在鏡下滴加0.9%氯化鈉溶液紅細胞恢復正常形態；第14天時紅細胞呈緊密線串樣并輕微變形，在鏡下滴加0.9%氯化鈉溶液紅細胞未恢復散開形態；保存至第21天時，線串樣凝集逐漸緊密，同時可見纖維蛋白絲析出在紅細胞團周圍，并出現團狀黏液結構（見圖2，插頁）。

2.3 自體成分組鏡下情況觀察成分分離后24h紅細胞未出現細胞凝集，紅細胞形態正常；保存7d的自體懸浮的紅細胞呈散在分布，出現微量棘狀突起。在鏡下滴加0.9%氯化鈉溶液紅細胞恢復正常形態；保存至第14天自體懸浮紅細胞呈散在分布，棘狀突起增多。保存至第21天自體懸浮紅細胞無凝集出現，呈散在分布，異形紅細胞增多（見圖3，插頁）。

2.4 3組游離紅細胞數目比較標準抗凝組除24h外，在第7、14、21天時游離紅細胞數目均明顯減少；擴大抗凝組24h紅細胞幾乎均呈游離狀態，于第7天約十分之一細胞出現凝集，但在第14天游離紅細胞數目明顯減少，至第21天時，只有個別紅細胞呈游離狀態；自體成分組自24h至第21天，在保存過程中紅細胞幾乎均呈游離狀態。詳見表1。

表1 3組游離紅細胞數目比較（個）

3 討論

自體輸血在婦產科應用日益廣泛[6-7]，但自體輸血在應用過程中，產婦妊娠期特殊的生理狀態，影響了自體血液的保存與回輸，進而影響了自體輸血在產科的應用[8-10]。國外有研究表明不建議在妊娠第三階段進行PABD[11]。這主要由妊娠期生理因素變化：妊娠3周開始孕婦血液中凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ逐漸增多，而抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）、組織纖溶酶原激活劑（t-PA）和腎合成的尿激酶（u-PA）降低，胎盤產生的纖溶酶原激活物抑制物增多[4]，血液漸趨高凝狀態，妊娠末期最明顯。由于孕婦血液的高凝狀態，在標準抗凝的條件下，孕婦血液隨著時間延長，血液呈現部分凝集。日本學者發現妊娠期采血的患者在自體血回輸時，在輸血器中發現血液凝塊[12]。可見標準抗凝的自體全血保存，隨著血液貯存時間的延長，血液容易出現凝集。這個結果與我們觀察結果相同。

從鏡下觀察結果來看，采用標準抗凝的妊娠期全血，實際上在24h已開始出現輕微凝集，保存第3天的全血中紅細胞在短時間內發生線串樣凝集，至保存第7天時的紅細胞呈緊密線串樣并輕微變形，而保存第14天時，可見纖維蛋白絲析出在紅細胞團周圍，并出現團狀黏液結構。保存至第21天時，出現黏液結構并呈團狀，紅細胞連接成網狀結構并部分溶血。游離紅細胞數目自第3天起開始急劇下降，這表明，由于妊娠晚期孕婦的血液處于高凝狀態，標準抗凝的自體全血超過3d實際上已經失去了回輸價值，因此對于妊娠晚期孕婦來講，采用標準比例抗凝是行不通的。

采用擴大抗凝的妊娠期全血，保存24h紅細胞呈散在分布，至第7天開始出現少量凝集，第14天時出串樣凝集，保存至第21天時，線串樣凝集逐漸緊密，游離紅細胞數目自第7天起逐漸減少，至第14天已經明顯減少，這表明擴大抗凝的妊娠期全血雖然能在一定程度上改善血液保存狀態，延緩血液凝固的時間，但對于保存期已超過7d的血液，仍不建議回輸，因為此時紅細胞已有較為明顯的不可逆的凝集，此時回輸雖不是絕對不可以，但回輸速度緩慢，輸血部位疼痛等問題出現的概率將明顯增加，影響臨床療效。

采用成分分離的自體血，自始至終紅細胞都維持游離狀態，計數200個紅細胞中游離紅細胞數量，不同時間點幾乎所有細胞均呈游離狀態，雖然隨著保存時間的增加，棘形紅細胞、異形紅細胞逐漸增多，但是較之于前兩組而言，血液保存質量仍舊得到了明顯的改善；而從實際效果上來看，自體成分血的回輸效果是最好的，不管是輸注速度，凝塊大小及數量，輸血的不良反應等，均是3種自體血保存方法中最優的。

綜上所述，由于妊娠晚期孕婦血液處于高凝狀態，標準比例抗凝方案已經不可取；擴大抗凝方案可以一定程度上延緩紅細胞聚集速度，但對于貯存期超過7d的血液，筆者仍不推薦使用；而對自體血進行成分分離保存，能夠較好的解決妊娠晚期孕婦血液易凝這一難題，是一種值得推廣的新方案。

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Comparison of three different methods for autologous blood storage in late pregnant women

DING Jiefeng,CHEN Haijiang,SANG Lieyong,et al.

Clinical Laboratory,Shaoxing Women and Children's Hospital,Shaoxing 312000,China

Objective To compare three different methods for autologous blood storage in late pregnant women.Methods One hundred and six pregnant women with indications of autotransfusion from January 2011 to June 2014 were enrolled.The autologous blood samples were collected and stored using three different methods:standard anticoagulation,extended anticoagulation and autologous components.The aggregation degree of red cells was observed under microscope(10×50)after 24h,7,14 and 21d of storage.Two hundred red cells of each group were observed and the number of free red cells was counted.Results The red blood cells in standard anticoagulation group began rouleau-like agglutination at d3 and the number of free red cells decreased dramatically;the red blood cells in extended anticoagulation began rouleau-like agglutination at d7 and the number of free red cells decreased dramatically at d3;while in autologous components group,nearly all red cells were free from 24h to 21d after storage.Conclusion The separation of the blood component is the best method for storage of autologous blood in late pregnancy.

Late pregnancy Autotransfusion Standard anticoagulation Extended anticoagulation Autologous blood components

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.20.2016-2109

浙江省衛生適宜技術成果轉化計劃項目（2016ZHB030）；浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2012KYB216）

312000紹興市婦幼保健院醫學檢驗科（丁杰鋒、吳云路），輸血科（陳海江、楊旦）；紹興市中心血站（桑列勇）

丁杰鋒，E-mail:djfyd@163.com

2016-12-15）

（本文編輯：嚴瑋雯）