固相萃取-超高效液相-串聯質譜法檢測水產品中漁藥殘留

張海霞 王迎迎

(哈爾濱市農產品質量安全檢驗檢測中心 黑龍江 哈爾濱 150070)

固相萃取-超高效液相-串聯質譜法檢測水產品中漁藥殘留

張海霞 王迎迎

(哈爾濱市農產品質量安全檢驗檢測中心 黑龍江 哈爾濱 150070)

在水產品養殖過程中,由于使用者對氯霉素、磺胺類、喹諾酮類漁藥及三苯甲烷類染料的毒性和危害認識不足,存在違規使用的現象.漁藥殘留常見危害為藥物通過較長時間的蓄積,對人體產生的慢性毒性作用.人們長期食用這類含漁藥殘留的水產品后,藥物在人體內蓄積,達到一定濃度后,就會對人體產生各種慢性毒性作用,損害肝臟、腎臟、消化系統、神經系統、造血系統、循環系統等.農業部235號公告規定了其限量標準,農業部和黑龍江省農監局每年要對水產品中這四類漁藥的殘留進行四次例行監測,以保證水產品的質量安全.目前,水產品中漁藥殘留的檢測方法主要有酶聯免疫吸附法、高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-串聯質譜法、液相色譜-串聯質譜法、電化學分析、毛細管電泳等,使用的前處理方法主要有液液萃取法、固相萃取法等.這些方法對漁藥殘留的檢測多是按同族藥物或單一藥物來開發,這些方法的不足之處在于僅可以檢測單一或幾個目標化合物,檢測效率低,成本高,造成檢測儀器設備、檢測人員的浪費.本實驗采用Prime HLB固相萃取柱凈化,超高效液相色譜-串聯質譜法一次性檢測4類12種漁藥殘留,檢測效率高,成本低,適用于越來越繁重的突發事件和應急監測工作.

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

儀器:超高效液相色譜-串聯四級桿質譜聯用儀Waters Acquity UPLC-TQD(美國Waters公司),配有電噴霧離子源;Milli-Q高純水發生器(美國Millipore公司);高速離心機(Sigma);高速組織勻質儀、渦旋振蕩器(IKA);氮吹儀(美國Organomation);pH計、電子天平(Mettler Toledo);超聲波清洗器(KUDOS);料理機(博朗);試劑:優級純的乙腈、甲酸、氯化鈉、鹽酸羥胺、對甲苯磺酸、無水乙酸鈉、冰乙酸(科密歐);乙腈、甲醇色譜純(美國Fisher公司);甲酸色譜級(迪馬);Prime HLB固相萃取柱(Waters);標準品均購自Dr.Ehrenstorfer.樣品:供試樣品鯉魚,購自當地超市.魚去鱗,取脊背上的魚肉,切成小塊,在料理機中絞碎.

1.2 樣品的提取

稱取5.0g絞碎的魚肉樣品于50mL具塞離心管內,加入混合內標工作溶液,渦旋混勻.加入1.5mL20%的鹽酸羥胺溶液,2.5mL1.0mol/L的對甲苯磺酸溶液,5.0mL乙酸鹽緩沖溶液,乙腈8mL,渦旋混勻后,超聲5min,再加入8g氯化鈉,渦旋混勻60s,7000r/min離心5min,收集上清液的乙腈層于50mL燒杯中.再向離心管中加入乙腈8mL,渦旋混勻60s,7000r/min離心5min,合并乙腈層的提取液.

1.3 樣品的凈化

Prime HLB固相萃取柱,加入與提取液pH值相近的甲酸乙腈1mL進行固相萃取小柱的活化.將50mL燒杯中的提取液轉移至固相萃取小柱,收集全部流出液,40℃下氮吹至近干.用200μL乙腈溶解后,800μL水定容至1mL,過0.22μm的濾膜.供超高效液相色譜-串聯質譜測定.

1.4 儀器條件

超高效液相色譜條件:色譜柱: Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7μm,2.1x50 mm );柱溫: 35℃; 進樣體積: 5μL;流速: 0.3mL/min;流動相1:A為乙腈, 流動相B為0.1% 甲酸溶液.具體洗脫程序:0～2.0min10～25%A,2.0～3.0min25～45%A,3.0～4.0min45～90%A, 4.0～5.5min90%A,5.6～7.0min10A.

質譜條件:離子源: 電噴霧電離源( ESI),正、負離子模式;源溫度: 110℃;毛細管電壓:+0.5kV,-2.0 kV;脫溶劑溫度:400℃;脫溶劑氣流速(N2):800L/h;錐孔氣速: 50L/h.采用MRM多反應檢測模式進行檢測.

2 結果與分析

2.1 提取方法

水產品中磺胺類、喹諾酮類和氯霉素的提取試劑主要有乙酸乙酯、甲醇、不同酸度的乙腈等,而孔雀石綠的提取采用了乙腈-鹽溶液或乙腈作為提取試劑[12].本實驗對比了乙腈和乙腈-鹽溶液對魚肉中的12種化合物的提取效率,結果表明,在使用單一的乙腈提取時,孔雀石綠、隱色孔雀石綠及其內標物的提取效率為零,沒有任何回收,其余的化合物的回收較好.采用乙腈-鹽溶液為提取試劑,在保證了磺胺類、喹諾酮類和氯霉素的提取效率的前提下,孔雀石綠和隱色孔雀石綠的回收率能滿足要求.水產品中漁藥殘留的提取主要有高速組織勻質、超聲波提取、震蕩提取,本實驗對以上三種提取方法進行對比.高速組織勻質機進行勻質提取時,由于魚肉較粘,會大部分樣品粘黏在勻質機的刀頭上,降低提取效率.震蕩和超聲波提取都能達到較好的提取效果,但震蕩提取時離心管是橫放在振蕩器上的,提取液容易從離心管蓋溢出,綜合考慮提取效率及可操作性,選取超聲波提取.

2.2 樣品凈化

基質效應是影響LC-MSMS定量分析準確性的重要因素.樣品凈化效果不好會影響化合物的離子化,基質效應強,導致色譜峰峰型不好,并且對色譜柱和質譜有污染.基質效應通過對每個待測物的基質增強或抑制進行評價.具體的計算公式為ME=Rm/Rsⅹ100%,其中Rm為目標化合物在空白基質溶液中的響應值,Rs為目標化合物初始流動相溶液中的響應值[13].固相萃取柱的基本操作步驟為活化、上樣、淋洗、洗脫.Prime HLB固相萃取柱的工作原理是吸附提取液中的雜質已達到凈化的目的,產品的使用方法是不用活化即可使用.為了驗證不活化的固相萃取柱的去除雜質的效果,比對了固相萃取柱不活化、樣品空白提取液活化和pH=1.40的甲酸乙腈(與提取液中的pH值相近)活化三種不同的方式.以基質效應的強弱來衡量不同活化方式的凈化效果.三種不同活化方式的基質效應比較見表1.由表可見,除隱色孔雀石綠為基質減弱效應外,其余參數的三種活化方式均為基質增強效應,其中樣品空白提取液活化和pH=1.40的甲酸乙腈活化的基質效應差異不明顯.使用樣品提取液進行活化,需要每次檢測前都找到陰性樣品,增加工作量和工作難度,最終本實驗選取pH=1.40的甲酸乙腈為活化試劑.

表1 三種不同活化方式的基質效應對比

2.3 質譜方法的優化

配制濃度為1mg/kg的12種漁藥及其內標物的標準溶液,以流動注射方式連續進樣,進行母離子掃描.按照歐盟(2002/657/EC)指令規定,低分辨率質譜聯用檢測應確定在母離子的基礎上選擇兩個以上子離子.在確定各個化合物母離子后,對其母離子進行碰撞掃描,每個化合物再選擇2個響應值高的特征離子對作為定量及定性離子,同時對其進行MRM參數優化.12種漁藥及其內標化合物中只有氯霉素及其內標物為ESI-模式,其余的參數均為ESI+模式.優化的質譜參數見表2.各化合物的總離子流圖見圖1.

表2 12種漁藥及內標標品多反應監測掃描模式(MRM)的質譜參數

圖1 12種化合物及其內標物的總離子流圖

2.4 液相方法的優化

由于這12種化合物及其內標物的化學性質差異較大,在質譜中采用了正離子和負離子的采集模式,為了使每個化合物能夠更好的離子化,需要對使用的流動相體系進行優化.根據查閱的文獻及本實驗室的工作經驗,對這12種化合物儀器分析時所采用有機相主要有乙腈、甲醇;水相主要有水、甲酸-水、乙酸銨.本實驗進樣適當濃度的混合標準品,對乙腈-5mmol/L乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-水三種流動相進行優化.各待測物在不同流動相體系中的響應值區別見圖2.由圖2可以看出,以乙腈-5mmol/L乙酸銨為流動相時氯霉素的響應值高,但喹諾酮化合物的響應值低,其中環丙沙星沒有響應;以甲醇-水為流動相時磺胺類化合物沒有響應或響應值低;以乙腈-0.1%甲酸為流動相時,氯霉素的響應值較以乙腈-5mmol/L乙酸銨為流動相低,但能滿足檢測需求,其他化合物的響應值均較高,也在檢測需求范圍內.最終選擇以乙腈-0.1%甲酸為流動相.

圖2 待測物在不同流動相體系中的響應值

2.5 方法的線性、檢出限和定量限

為了消除基質效應對定量結果造成的影響,以不含待測物的空白樣品為基質液,配制成基質標準溶液,磺胺類、氯霉素、喹諾酮類化合物濃度分別為10、50、100 、200、300、500、1000μg/mL,孔雀石綠和隱色孔雀石綠的濃度分別為5、10、15 、20、25、50、100μg/mL,進行方法線性的測定.以待檢參數的面積(y)為縱坐標,質量濃度(x)(mg/L)為橫坐標,建立標準曲線,得到線性回歸方程.線性范圍及相關系數見表3.以目標化合物在空白基質中的信噪比(S/N)來獲得檢出限和定量限,S/N=3時對應的含量為檢出限(LOD),S/N=10時對應的含量為定量限(LOQ).

表3 12種漁藥的線性范圍、線性方程及相關系數

2.6 方法的回收率、精密度

按照不同化合物的檢出限和國家規定的限量標準,每種化合物在樣品中添加低、中、高三種水平濃度的標品,每個水平重復6次,按照2.2的試驗方法進行處理,計算方法的回收率和精密度.具體的添加濃度、回收率和精密度見表4.回收率在70.3-118.7%之間,精密度為1.5-6.7%,符合國家檢測標準的要求.

表4 方法的添加回收率和精密度(n=6)

3 結論

本實驗采用乙腈-鹽溶液提取,Prime HLB固相萃取柱凈化,超高效液相色譜-串聯質譜分析,建立了能一次性檢測水產品中磺胺類、喹諾酮類、孔雀石綠以及氯霉素四類12種漁藥殘留的方法.通過對方法的檢出限、回收率、精密度、線性范圍等方法學進行驗證,該方法滿足對這12種漁藥檢測的要求.與傳統的方法相比,本實驗的方法快速、簡單、靈敏、成本低、效率高,適合實驗室進行批量樣品的檢測.

略)

張海霞 性別:女 職稱:高級農藝師 電話:15204666138 Email:zhanghaixianj@163..com