疫苗毒株胚蛋成活性檢測方法研究

黃 超 劉衍聰

(1.中國石油大學(華東)機電工程學院，青島 266580； 2.濱州學院電氣工程學院，濱州 256600)

疫苗毒株胚蛋成活性檢測方法研究

黃 超1,2劉衍聰1

(1.中國石油大學(華東)機電工程學院，青島 266580； 2.濱州學院電氣工程學院，濱州 256600)

針對人工光照法在生物疫苗毒株(胚蛋)成活性檢測中，存在勞動強度大、效率低、準確性差的缺點，提出了一種仿生胚蛋成活性圖像無損檢測方法。針對以往研究中胚蛋圖像上下灰度不一、胚蛋蛋殼質量不一等因素影響胚蛋血脈提取的問題，提出了一種基于最小類內指數方差的自適應閾值圖像處理方法。通過對去噪后的胚蛋圖像進行圖像邊緣檢測及數學形態學處理，準確構建了成活胚蛋主血脈二值形態，通過計算胚蛋內主血脈二值面積百分比判定胚蛋成活性。對胚蛋圖像進行識別實驗，結果表明，該系統識別一枚胚蛋用時0.093 s，胚蛋活性判定準確率為100%，可滿足滅活疫苗、凍干疫苗生產的活性準確率要求。

疫苗毒株； 成活性檢測； 圖像分割； 自適應閾值

引言

生物疫苗主要采用“雞胚法”生產，即將毒種注入雞胚中，毒種伴隨雞胚的發育自然繁殖，雞胚繼續發育3 d左右，每枚雞胚含有8～12 mL的半成品抗原[1-2]。雞胚孵化培養9～11 d后，向雞胚注射毒種(接種)，接種后繼續孵化2～3 d后，進行尿囊液提取(收獲)。在流感疫苗接種和收獲前，均需要對雞胚進行成活性檢測，剔除無精蛋、弱胚、死胚蛋，避免其污染正常胚蛋。國內疫苗毒株的成活性檢測采用光照法，查看雞胚血脈的粗細、血脈紋路確定雞胚的活性。長時間光照檢測不僅造成人眼視覺疲勞，易發生胚蛋的誤判，而且勞動強度大、效率低，雞胚離開孵化器時間長，影響雞胚的發育。因此，研制一種快速有效的雞胚成活性檢測方法，對疫苗制造行業具有重要意義。

國內學者對胚蛋成活性檢測技術進行了大量的研究[3-8]，研究成果加速了我國在胚蛋成活性自動檢測領域的發展。主要檢測手段有胚蛋透光度檢測、胚蛋表面溫度檢測、胚蛋失水率檢測等相關特征信息的自動檢測。由于胚蛋的蛋殼質量不一、胚蛋重量差別較大、孵化溫度變化率和環境溫濕度變化的影響，使得批量自動檢測胚蛋時，區分度變弱，難以準確判別胚蛋的活性。中國電子科技集團41所研發的胚蛋成活性自動檢測技術，實現了對孵化18 d后胚蛋的自動檢測。但是該技術不能應用于孵化16 d以內的胚蛋，針對這一問題，結合胚蛋檢測現狀和技術要求，提出一種仿生圖像自動檢測方法[9-22]，用以判別活胚、死胚和無精蛋，以確保胚蛋活性判斷的準確率。

1 胚蛋圖像的獲取

1.1 成像系統

成像系統采用海康威視30萬像素1/4″ CMOS 千兆以太網工業相機MV-CA003-20GM/GC，每個光源采用功率為1 W的LED冷白燈珠3顆。為得到蛋胚的清晰血紋圖像，采用內置LED燈珠的吸盤將蛋胚吸起后，通過胚蛋氣室投光，經胚蛋透光漫反射，在胚蛋側面成像。一次吸持15枚胚蛋，采用15臺工業相機同時取相，取相速度為15幅/(1.4 s)，每小時采集胚蛋圖像約為35 000幅。胚蛋圖像采集裝置如圖1所示。

圖1 胚蛋圖像采集裝置簡圖Fig.1 Acquisition device of embryonic image1.桁架移動電動機 2.胚蛋傳送帶 3.胚蛋吸盤 4.LED燈珠 5.工業相機 6.計算機 7.傳送帶電動機

1.2 光源與投射方式的確定

成相系統是對一行15個胚蛋同時拍照，胚蛋的間距較近。由于光源與胚蛋耦合不好，導致漏光現象，使光源照射到相鄰的胚蛋外殼上，產生反射光，從而將該胚蛋的折射光覆蓋掉，取照時容易取到蛋殼的本色，而不是胚蛋的血管紋理，因此失去判定依據，造成誤判。為此，吸盤采用多層皺褶式硅膠吸盤，吸盤的盤口形狀為倒錐形，在負壓的作用下，容易和胚蛋的外殼耦合。吸盤采用黑色，起到光線的阻擋作用，避免產生背景光，影響暗室拍照。胚蛋處于孵化10～11 d時，作為疫苗毒株培養毒種，該時期胚蛋發育的皮膚羽毛原基遍及全身，翼和腿部羽毛的尖端已微露，尿囊血管已在小端合攏，血管變多變粗，成樹狀分布。

胚蛋的大頭(有氣室端)朝上放置于蛋盤中，由于蛋盤的影響，注光燈在胚蛋上方和下方進行注光較方便且效率高。為確定注光方位，進行上下注光取相比較試驗，如圖2所示。大頭注光成像，圖像的灰度自上而下逐漸增大，胚蛋的血管紋路有2/3可以清晰可辨，能夠完成胚蛋的成活性判斷。小頭注光成像，圖像的灰度自下而上灰度逐漸增大，胚蛋的血管紋路只有1/3清晰可辨，不足以作為胚蛋成活性判定的依據。因此本系統的注光取相，采用胚蛋大頭吸持注光方式。

圖2 同一枚胚蛋大、小頭注光成像圖Fig.2 Light injection imagings of embryo egg’s different heads

1.3 成像過程

胚蛋大頭朝上放置于10行×15列的蛋盤中, 由傳送帶將整盤蛋傳送至暗箱中。到達暗箱后, 桁架在電動機的驅動下定位至最后一行胚蛋的正上方。胚蛋專用吸盤將15枚胚蛋吸起一定高度，脫離蛋盤，內置于吸盤的LED啟動，冷白光透過胚蛋的氣室將光投入胚蛋中，由15個相機一一對應進行取照，相機通過千兆交換機將胚蛋照片傳至計算機，吸盤下落將胚蛋放下，啟動桁架定位至下一行胚蛋的上方進行取照，完成10行胚蛋的取照后，傳送帶將蛋盤送出暗室。

1.4 相機視野的確定

胚蛋在10～11 d時，需完成接種前的胚蛋成活性檢測，以及入庫前的成活性檢測。胚蛋在這個時期，尿囊血管在胚蛋小頭合攏，整個胚蛋除了氣室都布滿了血管，且血管變粗、顏色變暗。這個時期給胚蛋投光成像，上半部分血管紋理清晰，而下半部分由于胚胎及血管對光線的吸收和阻礙作用，圖像變得灰暗不清。為確保相機取相傳輸的速度，每個相機為30萬像素，在1.4 s時間內完成15幅圖像的傳輸。圖像的大小影響圖像的處理和血管紋路的提取速度，影響胚蛋的成活性判定效率。為了使胚蛋圖像信息能夠滿足圖像識別的要求，又能實現圖像的快速處理和提高血管紋理的提取效率，因此只需按照圖像上半部分血管紋路就能判定胚蛋的活性。調整相機的視野時，應盡量避免包含暗箱背景和相鄰胚蛋，來提高胚蛋圖像的有效信息比。相機視野范圍的調整，不影響圖像的大小，對圖像傳輸、處理存儲沒有影響。采用無畸變鏡頭的放大倍數為6～12，在調整相機視野時，由于相機視野的長寬比，胚蛋的小端部分圖像采集不到，圖像的采集如圖3所示。

2 基于圖像處理的胚蛋成活性判斷

2.1 胚蛋血脈紋理分割

由于圖像在采集過程中受到環境影響，不同批次所采集的圖像會有所差異(圖3)，從而影響毒株血脈紋理的提取。在兼顧圖像采集效率的情況下，無法完全保證拍攝環境亮度一致，針對這一問題，本文提出了自適應血脈紋理提取方法。按照圖像的明暗程度進行分類，采用不同圖像處理方法對所采集的圖像進行血脈分割和提取。

圖3 胚蛋圖像Fig.3 Embryonic images

胚蛋圖像亮度對其內部紋理的提取具有很大程度的影響，且胚蛋區域基本位于圖像的中間。首先將RGB圖像轉換成HSV圖像，然后在V分量圖像中提取位于中部的一個50像素×50像素子區域，并計算此區域的亮度均值，實現依據圖像采集質量進行自動分類。然后設定閾值，來判斷圖像的亮度，針對不同亮度的圖像，采用不同的血脈提取方法。

2.1.1較亮圖像的處理

對于質量較高的圖像，圖像亮度較高，比較容易將胚蛋從背景中分割出來。經過對胚蛋圖像各分量的研究發現，血脈在G分量圖像上相對比較明顯，因而在G分量圖像上進行血脈提取。具體步驟如圖4所示。

(1)對G分量圖像G=fg(x,y)采用全局閾值T進行分割，得到二值圖像，記為Ib1，與自適應閾值得到二值圖像進行異或。

圖4 較亮圖像的血脈提取過程Fig.4 Blood extraction process for lighter image

(1)

式中b(x,y)——圖像二值函數

(2)由于所采集圖像的亮度差別較大，采用全局閾值無法直接將血管分離出來，為使分割算法適應不同亮度圖像，采用基于最小類內指數方差的自適應閾值分割方法進行圖像分割。

假設圖像I=f(x,y)的尺寸為M×N，且具有L個灰度等級，設J={0,1,2,…,L-1}為灰度級集合，g(x,y)表示像素點(x,y)處的區域平均灰度。因此，圖像的像素本身灰度f(x,y)和其鄰域均值g(x,y)聯合概率函數為

h(m,n)=Prob(f(x,y)=m&g(x,y)=n)

(2)

圖像的二維直方圖綜合了像素的空間關系，便于更好地呈現像素的分布情況。通過閾值向量(t，s)對圖像進行分割，t為圖像像素本身灰度f(x，y)的閾值，s為其鄰域均值g(x，y)的閾值[6]。將圖像的二維直方圖進行劃分，如圖5所示。

圖5 二維直方圖的區域劃分Fig.5 Division of two-dimensional histogram

圖5中，分割線L1和L2平行于主對角線((0，0)到(L-1，L-1))，直線L1和L2之間區域像素點的灰度級及其鄰域平均灰度差別不大，認為是圖像的目標和背景內點區；L3、L4平行于主對角線，L2與L4和L1與L3之間的兩區域點的灰度級及其鄰域平均灰度有一定差別，將該區域定義為目標和背景之間過渡的邊界區；L4右下方及L3左上方區域像素的灰度級與其鄰域灰度均值差別很大，認為是圖像的噪聲點區。設直線L5的方程為

g=-f+T

(3)

令L5的右上方為目標O，L5的左下方為背景B，背景和目標的類概率分別為

(4)

PO(T)=1-PB(T)

(5)

式中P(i,j)——聯合灰度值概率

i——像素本身灰度

j——鄰域灰度均值

圖像的所有像素對于自身灰度和鄰域平均灰度均值矢量為

(6)

式中μi——像素對于自身灰度矢量

μj——像素對于鄰域平均灰度矢量

背景和目標類的均值矢量為

(7)

(8)

式中μBi——背景自身灰度均值矢量

μBj——背景鄰域灰度均值矢量

μOi——目標自身灰度均值矢量

μOj——目標鄰域灰度均值矢量

背景和目標的類內指數方差分別為

(9)

(10)

(11)

最小化圖像的總體類內指數方差，得到最佳閾值

(12)

得到最佳閾值T*后，將圖像二值化為目標、背景

(13)

其中，fb(x，y)為分割后的二值化圖像，目標灰度為1，背景灰度為 0，將得到的二值圖像記為Ib2。

(3)將二值圖像Ib1和Ib2進行異或操作(XOR)得到圖像Ib，將胚蛋內的血管紋理變成白色

fb(x,y)=fb1(x,y)⊕fb2(x,y)

(14)

式中fb1(x,y)——全局閾值得到的二值圖像

fb2(x,y)——自適應閾值得到的二值圖像

(4)為得到胚蛋內的血脈，將步驟(3)得到的圖像Ib與腐蝕后的Ib1進行與運算(AND)，這樣就只保留了胚蛋內的血脈紋理圖像。

fb(x,y)=fb(x,y)∧fb1(x,y)

(15)

2.1.2較暗圖像的處理

對于較暗圖像，直接對G分量進行圖像分割不能將胚蛋從背景中提取出來。經過對胚蛋圖像的RGB各顏色分量進行分析，參考Ohta顏色系統[7]，經過多次實驗驗證，發現使用

I=2.5R-2G-0.5B

(16)

計算特征值I(其中R、G、B分別表示3個顏色分量)能夠將胚蛋從復雜背景分離出來，并將復雜的背景轉換為單一的黑色，使用全局閾值就可以很容易將胚蛋從背景中分離出來。

血脈提取的效果如圖6所示，具體步驟為：

(1)根據式(16)計算特征值I，并采用全局閾值52(實驗測得)進行二值化，得到二值圖像Ib1。

(2)根據所得到的二值圖像Ib1，將G分量圖像的背景部分變為黑色，然后對其采用自適應閾值法[6]進行圖像分割，得到二值圖像Ib2。

(3)將二值圖像Ib1和Ib2進行異或操作，將胚蛋內的血管脈絡變成白色。

(4)為了得到胚蛋內的血脈，將步驟(3)得到的圖像與腐蝕后的圖像Ib1進行與運算，這樣只保留了胚蛋內的血脈紋理圖像。

圖6 較暗圖像的血脈提取過程Fig.6 Blood extraction process for darker image

2.2 疫苗毒株成活性判斷

通過分類識別，識別率基本滿足需求，生產工藝允許將活胚誤判定為死胚，但不允許將弱胚或者死胚判定為活胚。將胚蛋里面的血脈提取出來后，接下來就根據所提取的脈絡判斷是否為活胚。如果所提取的脈絡為樹狀血脈(圖7a)，則為活胚；若為血脈不連續或模糊團塊(圖7b、7c)，則為死胚。

為了判定可靠，采用兩步判定法。第1步，在二值圖像中尋找最大連通區域記為P，然后分別計算區域P的輪廓周長和面積(像素數)，記為Pl和Pa，接著計算區域P的面積和周長比R=Pa/Pl。通過樣本測試，選取閾值為0.94，如果R≥0.94，則為死胚；否則為活胚。通過該判別方法，將圖7c中的死胚剔除，但無法剔除圖7b中的死胚。第2步，對所提取的血脈結果的二值圖像，尋找最大聯通區域，將最大血脈區域面積與胚蛋的面積百分比作為胚蛋成活性判斷的標準

圖7 不同類型的胚蛋血脈提取結果Fig.7 Extraction results of different types embryo blood

(17)

式中Au——胚蛋血脈最大聯通區域面積

Ae——整個胚蛋面積

通過求取圖7中二值圖像的最大血脈面積占整個胚蛋面積的百分比，即使最后獲得的二值血脈結構圖中存在少量的孤點噪聲像素，也不會影響γ值，不會對最終的判別結果產生實質性影響。

根據獲取的胚蛋特征值γ，可以使用貝葉斯分類器對被檢胚蛋進行快速分類[8]。首先對樣本訓練組的1 000枚胚蛋(840枚活胚、160枚死胚)進行訓練，提取特征參數γ并生成盒狀圖(圖8)。

圖8 特征參數γ盒圖Fig.8 Box diagram of characteristic parameter γ

可見，特征參數γ對活胚和死胚具有很大的區分度，我們使用貝葉斯分類器來確定特征參數γ的分類閾值，貝葉斯分類函數可定義為[5]

g(x)=WTx-W0

(18)

其中

(19)

W——系數矩陣W0——分類閾值

根據所提取的活胚和死胚兩類樣本的γ特征均值，可以得到分類閾值W0。但由于在實際檢測中，生產工藝允許將活胚誤判定為死胚，但不允許將弱胚或者死胚判定為活胚。因此，我們在確定分類閾值時，還需要考慮死胚的特征參數γ的最大值，分類閾值W可定義為

(20)

其中，W0是由式(17)計算得到的分類閾值，γmax為死胚的特征參數γ的最大值。通過分類閾值，將圖7b中的死胚進行剔除。經過兩步判定，針對不同類型的死胚，可實現對圖7b、7c中死胚的剔除。

3 實驗結果與分析

實驗在某疫苗廠進行，實驗樣機如圖9所示。

圖9 檢測裝置測試圖Fig.9 Test chart of test device1.數字相機 2.垂直桁架電動機 3.水平桁架電動機 4.水平傳動模組 5.垂直傳動模組 6.胚蛋吸持模組

根據上述兩步的毒株成活性判定法，對疫苗廠的600枚10日齡胚蛋進行胚蛋成活性在線實時檢測，檢測結果如表1所示，其中準確率Pe、漏判率Pm和誤判率Pw定義為

(21)

式中Qa——活胚個數QTA——胚蛋總數

Qm——死胚被誤判成活胚個數

Qw——活胚被錯判為死胚個數

表1 胚蛋成活性檢測結果Tab.1 Test results of embryo egg activity

由表1可以發現，人工檢測和無損檢測的漏判率均為0。自動檢測在胚蛋判別的準確度上接近人工檢測，影響自動檢測準確度的原因主要是圖像采集角度和采集質量，以致獲得的圖像的血管面積比較小。為了確保活胚的健康性，特意將血管紋理面積比的參數調高，因此使得自動檢測的錯判率稍高，但在允許范圍內，保證了活胚率。人工檢測平均效率為0.4 s/枚，自動檢測的平均效率為0.093 s/枚，綜合檢測效率和穩定性，自動檢測的優勢更為明顯。

4 結束語

為了提高接毒胚蛋成活性自動檢測的準確性和高效性，采用氣室注光的透射取相法，最大限度地得到胚蛋清晰血管紋路圖像。提出了基于最小類內指數方差的灰度自適應算法，實現了胚蛋圖像上、下兩部分的血管紋路提取。通過對所提取的紋路采用基于面積周長比的區域形狀判斷法，消除了胚蛋圖像血環、干涸胚胎、蛋殼裂紋的影響。通過計算胚蛋的最大血脈區域面積與胚蛋的面積比，采用貝葉斯分類方法完成了胚蛋在線實時分類。實驗數據表明，無損檢測系統的每枚胚蛋成活性判定平均用時0.093 s，分揀出胚蛋的活胚率為100%，滿足滅活、凍干苗的疫苗毒株活性判別的生產要求。

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ExperimentonDetectionMethodofVaccineStrainActivity

HUANG Chao1,2LIU Yancong1

(1.CollegeofMechanicalandElectronicEngineering,ChinaUniversityofPetroleum,Qingdao266580,China2.CollegeofElectricalEngineering,BinzhouUniversity,Binzhou256600,China)

Given the high labor intensity, low efficiency and poor accuracy of the artificial lighting method in the detection of biological vaccine strain, embryo egg, activity, a bionic embryonic egg activity image nondestructive detection system was designed.Considering the blood vessel extraction was affected by factors such as the uneven gray level of the embryo egg image and the uneven eggshell quality of the embryo egg, an adaptive threshold method based on the minimum class inner exponential variance was proposed to segment the image and extract the blood.Arterial inclusion of egg embryo imaging was a critical factor for the accuracy of the fertility detection.By analyzing the development process and lighting experiment of egg embryo, it was found that the method shooting light at the bigger part and imaging from the side was an optimal way for the egg embryo imaging.In embryo egg image acquisition, the brightness of the image was varied under the influence of the camera environment and the image acquisition system.In view of this problem, the V component was used to realize automatic image classification, and then the image process was performed respectively.The main blood vessel of the active embryo egg was constructed accurately through the image edge detection and mathematical morphology process of the denoised embryo egg image, and the embryo egg activity was determined by calculating the two values area percentage and area perimeter ratio of the main blood vessel in the embryo egg.Experimental results showed that the system can recognize one embryo egg with 0.093 s, and the detection accuracy of embryo egg activity was 100%.This system can meet the accuracy requirement of the production of inactivated vaccine and freeze-dried vaccine.

vaccine strains； fertility detection； image segmentation； adaptive gray value

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.10.038

TP391.4

A

1000-1298(2017)10-0300-07

2017-06-03

2017-07-25

國家自然科學基金項目(51405512)和山東省重點研發計劃項目(2016GNC112015)

黃超(1981—)，男，博士生，濱州學院講師，主要從事智能控制與檢測技術研究，E-mail：hc8247@163.com

劉衍聰(1962—)，男，教授，博士，主要從事工程圖學及機器視覺識別技術研究，E-mail：liuycupc@163.com