彌漫性大B細胞淋巴瘤組織中Bcl-6基因異常情況及其臨床意義

于海，張云香，王慧，張娜

(1濰坊醫學院,山東濰坊 261053；2濰坊市人民醫院)

彌漫性大B細胞淋巴瘤組織中Bcl-6基因異常情況及其臨床意義

于海1，張云香2，王慧2，張娜2

(1濰坊醫學院,山東濰坊 261053；2濰坊市人民醫院)

目的觀察彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)中Bcl-6基因異常情況，并分析其與臨床病理特征的關系。方法DLBCL患者42例，采用Bcl-6雙色斷裂點分離探針熒光原位雜交技術檢測Bcl-6基因，采用免疫組織化學方法檢測Bcl-6蛋白表達，采用χ2檢驗分析Bcl-6基因異常與DLBCL臨床病理特征的關系。結果42例DLBCL患者中發生Bcl-6基因易位6例，發生Bcl-6基因擴增3例，Bcl-6蛋白表達陽性19例。Bcl-6基因易位患者Bcl-6蛋白表達陽性率較無易位者高(P=0.014)；Bcl-6基因是否易位患者DLBCL分型、性別、年齡比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。Bcl-6基因是否擴增患者Bcl-6蛋白表達、DLBCL分型、性別、年齡比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。結論DLBCL中Bcl-6基因存在易位和擴增兩種情況，并且Bcl-6基因易位與患者Bcl-6蛋白表達有密切的聯系。

彌漫性大B細胞淋巴瘤；Bcl-6；基因異常；臨床指標

彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是一種高度異質性的淋巴系統惡性腫瘤，是最常見的侵襲性淋巴瘤。在歐美國家，DLBCL占非霍奇金淋巴瘤的30%左右，而在我國，其發病率高達40%。既往大量證據證實，不同類型的淋巴瘤在基因學、病理形態以及治療反應性等方面均存在明顯差異，尤其是基因異常改變對指導療效和評估預后具有十分重要的臨床意義。因此，深入研究各種類型的分子遺傳學特征，進一步了解其具體的發病機制并為精準醫療提供理論依據已成為當前研究的熱點。Bcl-6是一種具有下調基因轉錄而抑制細胞凋亡功能的原癌基因。生理情況下，Bcl-6只表達于生發中心。當發生DLBCL后，Bcl-6因發生斷裂重排或擴增，異常表達的Bcl-6可以通過抑制PRDM1和p53等的表達從而促進DLBCL的發生和發展[1]。故存在Bcl-6基因異常的患者預后不佳。最近，在2016版世界衛生組織(WHO)淋巴腫瘤修訂分類中，將伴MYC和Bcl-2和(或)Bcl-6重排的該部分患者分類為高侵襲性B細胞淋巴瘤[2]。可見，進一步明確Bcl-6基因在DLBCL中的異常改變對指導臨床具有重要意義。本研究觀察了DLBCL中Bcl-6基因異常情況，并分析其與臨床病理特征的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集濰坊市人民醫院病理科2015年1月～2016年10月病理首次診斷為DLBCL的患者42例。其中男26例、女16例，年齡43～80(58.91±12.31)歲。分型參照2008年WHO關于造血與淋巴組織腫瘤分類標準[3]，其中GBC型16例、n-GCB型26例。納入標準：全部病例診斷均符合《2008年WHO淋巴瘤診斷標準》；全部研究對象均未接受化療或放療；年齡≥18歲，資料完整。排除壞死性淋巴結炎、傳染性單核細胞增多癥、轉移性腫瘤和髓外白血病等疾病。標本部位：淺表淋巴結27例，皮下軟組織6例，胃腸道6例，腸系膜、脾各1例，扁桃體1例。標本均經4%甲醛固定，常規石蠟包埋，制作成簡易組織芯片蠟塊。

1.2 Bcl-6基因檢測 采用熒光原位雜交技術(FISH)。3 μm石蠟切片常規處理后，使用Bcl-6雙色斷裂點分離探針(北京金菩嘉，中國)檢測Bcl-6基因，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。在熒光顯微鏡(Olympus BX51，日本)下觀察，應用FISH圖像分析軟件進行圖像采集、分析和保存。正常Bcl-6基因表現為2個紅色和綠色熒光融合的黃色信號；Bcl-6基因易位顯示為1個紅色、1個綠色、1個黃色信號；Bcl-6基因擴增顯示為≥3個黃色信號。將20例反應性增生的淋巴結標本按上述方法進行FISH實驗，每份樣本分析200個細胞，計算出異常信號的細胞數，百分比平均數及標準差，陽性閾值=平均值+3倍標準差。本研究將Bcl-6基因易位陽性閾值定義為11%，即分析100個腫瘤細胞中出現11個及11個以上陽性細胞即判斷為Bcl-6基因易位。Bcl-6基因擴增陽性閾值定義為12%，即分析100個間期細胞中出現12個及12個以上細胞顯示≥3個黃色信號判斷為Bcl-6基因擴增。

1.3 Bcl-6蛋白表達檢測 采用免疫組織化學法。石蠟切片常規脫蠟后，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法檢測觀察組組織中Bcl-6蛋白表達水平(兔抗人單克隆抗體，1∶100，北京中杉金橋，中國)。DAB顯色后，蘇木素復染。PBS緩沖液替代一抗作為空白對照。染色步驟嚴格按照說明書進行。結果判定：蛋白陽性呈棕褐色、棕黃色或淺黃色表達，主要位于細胞核。根據既往蛋白免疫組化判讀標準[4]，以腫瘤組織中陽性細胞百分率計數。同時，按照Hans等[5]分類標準，最終將Bcl-6蛋白>30%定義為陽性表達。所有評判均由兩名高年資病理醫師完成。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。各因素組間差異比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DLBCL患者Bcl-6基因異常情況 42例DLBCL患者中發生Bcl-6基因易位6例，發生Bcl-6基因擴增3例，無Bcl-6基因擴增重排，Bcl-6基因異常率為21.43%。

2.2 DLBCL患者Bcl-6蛋白表達情況 42例DLBCL患者中Bcl-6蛋白表達陽性19例。

2.3 Bcl-6基因易位與DLBCL臨床病理特征的關系 見表1。

表1 Bcl-6基因易位與DLBCL臨床病理特征的關系(例)

2.4 Bcl-6基因擴增與DLBCL臨床病理特征的關系 見表2。

表2 Bcl-6基因擴增與DLBCL臨床病理特征的關系(例)

3 討論

既往大量證據表明，DLBCL患者無論在臨床表現、病理形態、治療反應性及預后，還是腫瘤細胞的表型及基因遺傳學均表現出高度異質性[6]。近年來隨著分子遺傳學領域研究的不斷發展，人們發現基因異常在DLBCL發生發展、指導治療方案和評估預后起著重要的作用。其中，Bcl-6基因異常是調控DLBCL發生發展的關鍵基因之一。研究顯示，Bcl-6基因不僅在調控B細胞生發中心的形成中起重要作用[7]，而且可以通過調節B細胞的活化、分化、細胞周期和凋亡作用影響DLBCL[8]。Bcl-6基因生物學活動是一個復雜的多信號傳導的級聯反應,作用機制仍不十分清楚。目前有證據表明，Bcl-6基因的突變和染色體異位是發生腫瘤的基礎，也是Bcl-6基因異常最主要的兩種方式。當Bcl-6基因發生易位或擴增后，其蛋白表達失去有效的調節，異常表達的Bcl-6可以直接調節腫瘤細胞的分化、增殖和凋亡而直接促進腫瘤生長[9]。此外，Bcl-6基因亦能通過調節其他基因的表達而調節腫瘤生長，如STAT和Blimp-1等[10]。這也提示，相關基因異常可能是引起DLBCL不同治療反應性和預后差異的重要原因。因此，研究相關基因的具體作用機制對指導臨床治療和評估預后具有至關重要的意義。

既往大量證據表明，MYC基因異常可作為Burkitt淋巴瘤的遺傳學特征之一。但對于DLBCL，則缺乏特異性的分子遺傳學標志物。國內外研究發現，DLBCL患者中存在較常見的Bcl-6基因異常。國外研究報道，Bcl-6基因易位在DLBCL中檢出率為23.1%[11]；而我國研究顯示，Bcl-6基因易位檢出率高達57.5%[12]。這提示，地區差異可能是發生Bcl-6基因異常差異的重要原因。本研究DLBCL患者Bcl-6基因異常檢出率僅為21.43%，與國內其他學者報道不同，原因可能與納入的研究對象有關。

本研究結果顯示，42例DLBCL患者中發生Bcl-6基因易位者6例，且6例患者全部表達為Bcl-6蛋白。而Bcl-6蛋白陰性患者中，無基因易位者。這提示，Bcl-6基因易位與蛋白表達之間有密切的相關性。按照Hans分型標準，將全部研究對象分為GCB型和non-GCB型后，進一步分析結果顯示，Bcl-6基因易位與Hans分型無相關性，這提示，在臨床上不能通過Hans分型來評估患者的Bcl-6基因易位情況。同時，本研究亦顯示，Bcl-6基因易位與患者性別和年齡無相關性。

此外，本研究結果顯示，有3例患者發生Bcl-6基因擴增(7.14%)，這與韓永勝等[13]報道的Bcl-6基因擴增檢出率為17.2%差異較大，原因可能有多種。3例發生Bcl-6基因擴增患者中蛋白表達陰性2例、陽性1例。進一步分析顯示，Bcl-6基因擴增病例與無擴增病例中的Bcl-6蛋白表達、性別及年齡均無統計學差異。

綜上所述，DLBCL中Bcl-6基因存在易位和擴增兩種情況，并且Bcl-6基因易位與患者Bcl-6蛋白表達有密切的聯系。因此，對于Bcl-6蛋白表達陽性的患者，發生Bcl-6基因易位的可能性大，建議行FISH檢測,從而指導其臨床治療。Bcl-6基因擴增也是DLBCL中基因異常的重要方式，目前國內外研究較少，對其作用機制尚缺乏了解，值得進行深入研究。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.024

R733.4

B

1002-266X(2017)38-0076-03

山東省濰坊市科學技術發展計劃項目(20100220)。

張云香(E-mail： zhangbing199592@163.com)

2017-07-10)