老年支氣管哮喘患者PAI-1、STAT2基因多態性分析

操麗芳，高穎，管立學，張華芳，李蕾，李峰

(1濰坊醫學院，山東濰坊 261041；2濰坊市人民醫院)

老年支氣管哮喘患者PAI-1、STAT2基因多態性分析

操麗芳1，高穎2，管立學2，張華芳2，李蕾2，李峰2

(1濰坊醫學院，山東濰坊 261041；2濰坊市人民醫院)

目的探討老年支氣管哮喘(簡稱哮喘)患者纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)、信號轉導子及轉錄激活因子2(STAT2)基因多態性。方法選擇80例老年哮喘患者(哮喘組)及80例老年健康查體者(對照組)。采用PCR擴增方法檢測兩組靜脈血PAI-1基因啟動子區基因型(4G/4G型、5G/5G型、4G/5G型)和STAT2基因型(CG型、GG型、CC型)。結果哮喘組PAI-1基因4G/4G、4G/5G、5G/5G基因型及4G等位基因分別為33、36、11、102例，對照組分別為17、41、22、75例，除4G/5G基因型外，其他指標兩組相比P均<0.05。哮喘組STAT2基因CC、CG、GG基因型及C等位基因分別為0、7、73、7例，對照組分別為0、3、77、3例，兩組相比P均>0.05。哮喘組PAI-1基因型為4G/4G且STAT2基因型為GG例數高于對照組(P均<0.05)。PAI-1基因型為4G/4G且STAT2基因型為GG發生哮喘的相對風險OR=2.22，95%CI=1.1～4.5，P<0.05。結論PAI-1基因4G/4G基因型是老年哮喘發病的易感基因型；STAT2基因CG多態性與老年哮喘無明顯關聯；PAI-1基因4G/4G基因型和STAT2基因GG基因型在老年哮喘發病上具有協同作用。

纖溶酶原激活物抑制劑1；信號轉導子及轉錄激活因子2；單核苷酸多態性；老年人；哮喘

近年我國支氣管哮喘(簡稱哮喘)病患數量日益增長，其中老年哮喘發病率、病死率呈遞增趨勢。哮喘是由多種炎性細胞和炎癥介質相互作用的慢性氣道炎癥疾病，各型各期哮喘的共同病理學特征均為氣道炎癥。研究[1]顯示，哮喘的發生、發展受遺傳和環境因素的雙重影響，其中遺傳因素在哮喘中起到極為重要的作用;目前發現的與哮喘病相關基因超過80個，幾乎涵蓋所有人類染色體。纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)是纖溶蛋白溶解系統的主要抑制劑，是纖維蛋白形成和降解的主要調節因子。信號轉導子及轉錄激活因子2(STAT2)是由STATs基因編碼并在胞質內以一種潛在的單體形式存在的蛋白家族成員。STATs家族在組織和細胞中分布廣泛，可介導多種細胞因子、生長因子等信號向細胞核內轉導，調節細胞功能，在炎癥性疾病及免疫性疾病中發揮重要作用[2]。PAI-1通過加重細胞外基質沉積，產生氣道重塑；STAT2通過JAK-STAT信號通路產生生長因子、炎性細胞浸潤促進氣道慢性炎癥及氣道重塑；兩者是否在哮喘產生過程存在協同作用，目前國內外無相關研究報道。本研究分析了老年哮喘患者PAI-1、STAT2基因多態性，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年10月～2016年10月來濰坊市人民醫院就診的80例老年哮喘患者(哮喘組)，其中男43例、女37例，年齡65～95歲、平均74.6歲。哮喘診斷參照《支氣管哮喘防治指南2008版》[3]診斷標準。另選擇與哮喘組患有相同基礎疾病的我院非哮喘老年健康查體者80例(對照組)，經病史、體檢、實驗室、X線及心電圖檢查，排除肺間質病、支氣管擴張、肺癌及致肺部病變的全身免疫性疾病。對照組中男49例、女31例，年齡65～83歲、平均71.2歲。兩組一般資料具有可比性。本研究經過患者本人和家屬知情同意，并獲我院醫學倫理委員會批準。

1.2 PAI-1、STAT2基因多態性觀察方法

1.2.1 基因組DNA抽取 采集所有研究對象靜脈血2 mL，EDTA抗凝，應用STMT buffer處理抗凝靜脈血，采用酚/氯仿法提取基因組DNA。

1.2.2 PAI-1基因引物序列設計 參考文獻由Sangon公司合成，擴增引物位于PAI-1基因5′端啟動子區-555～-697 bp，上游引物為5′-CACAGAGAGAGTCTGGCCACGT-3′(C為非配對堿基)，下游引物為5′-CAGCCACGTGATTGTCTAGGT-3′。PCR反應條件:反應體系為25 μL，含基因組DNA 100 ng，引物各0.3 μmoL，Tag DNA聚合酶1.0 U。采用PTC-100型PCR擴增儀(美國MJ公司生產)擴增。反應條件：先94 ℃預變性5 min，再按94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s的程序共循環35個周期，最后72 ℃延伸10 min。并采用限制性內切酶消化PCR產物，其反應體系20 μL，PCR產物5 μL，限制酶BseLⅠ(Fermentas Life Sciences)10 U，37 ℃，酶切3 h。最終行12% PAGE電泳分型，AgNO3染分析基因型。PAI-1基因PCR產物為142 bp，經BseLⅠ酶切消化后產生不同的特異性片段，有3種基因型：4G/4G型產生96、46 bp 2條帶，5G/5G型產生74、46、22 bp 3條帶，4G/5G型產生96、74、46、22 bp 4條帶。

1.2.3 STAT2基因引物序列設計 參考文獻由Sangon公司合成，對rs2066807C→G多態位點進行檢測。PCR引物設計：P1為5′-CTCGGAAGGTGGCTAATGTC-3′，P2為5′-AAAGGAGAGGCTGTGGAAAT-3′。PCR反應條件:反應體系為25 μL，含基因組DNA 100 ng，引物各0.3 μmoL，Tag DNA聚合酶1.0 U。采用PTC-100型PCR擴增儀(美國MJ公司生產)擴增。反應條件：先94 ℃預變性5 min，再按94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s的程序共循環35個周期，最后72 ℃延伸10 min。并采用限制性內切酶消化PCR產物，其反應體系20 μL，PCR產物10 μL，內切酶Tth111Ⅰ 10 U，置37 ℃水浴，消化3 h。最終采用6%PAGE電泳分型，AgNO3染色后觀察酶切結果。STAT2基因有3種基因型：CG型擴增產物為長366、244、122 bp 3條帶，GG型擴增產物為長244、122 bp 2條帶；CC型擴增產物為長366 bp 1條帶。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。用直接計數法計算各等位基因的表型頻率；χ2檢驗分析兩組PAI-1和STAT2基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律；用χ2檢驗和比值比(OR)分析PAI-1、STAT2基因與老年哮喘的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗結果 哮喘組、對照組PAI-1和STAT2基因達到遺傳平衡，具有代表意義。

2.2 兩組PAI-1基因型與等位基因分布情況 見表1。

表1 兩組PAI-1基因型與等位基因分布比較(例)

注：與對照組相比，#P<0.05。

2.3 兩組STAT2基因型與等位基因分布情況 兩組STAT2基因型與等位基因分布比較P均>0.05，見表2。

表2 兩組STAT2基因型與等位基因分布比較(例)

2.4 兩組PAI-1與STAT2聯合基因型分布比較 見表3。PAI-1基因型為4G/4G且STAT2基因型為GG發生哮喘的相對風險OR=2.22，95%CI=1.1～4.5，P<0.05。

表3 兩組PAI-1與STAT2聯合基因型分布比較(例)

注：與對照組相比，#P<0.05。

3 討論

哮喘是氣道慢性炎癥疾病，病理生理學主要特征為氣道重塑、氣道炎癥。哮喘的發生與炎癥刺激氣道致氣道重塑有關，而宿主易感性及環境各方面因素可共同導致氣道炎癥，并促進氣道內黏液分泌增加、水腫等改變，進一步為炎癥浸潤提供條件，加重哮喘。老年人肺基礎功能相對減弱，氣道對刺激的敏感性逐漸降低，所以臨床上老年患者易出現急性哮喘，且極有可能為危重型哮喘合并呼吸衰竭，威脅患者生命[4]。因此，研究哮喘易感基因型將有助于發現高危老年人群，并有利于及早合理選擇有效預防及治療方案，改善老年患者生活質量。

氣道炎癥導致氣道高反應，炎性細胞在其環節中起著至關重要的作用，其中尤為重要的是肥大細胞的激活。在IgE介導下，肥大細胞迅速脫顆粒釋放炎性介質(包括5-羥色胺、白三烯B4、前列腺素D2)，而這些介質可直接增高過敏性哮喘速發型變態反應，導致血管通透性增強、支氣管痙攣、黏膜水腫、黏液分泌增加等[5]哮喘過敏反應，并且哮喘患者肥大細胞也可分泌PAI-1參加哮喘的發生。有研究[6]表明，PAI-1通過抑制基質金屬蛋白酶和纖維蛋白溶解酶的活性促進氣道的膠原沉積，促進氣道高反應、過敏性炎癥、氣道重塑的發生，加重哮喘。PAI-1作為PAI系統中發揮60%的纖溶酶原抑制作用的特異性抑制物[5]，它的編碼位于7號染色體長臂(q21.3～22)，全長12.2 kb，包含了9個外顯子和8個內含子。目前研究[7]發現，PAI-1基因上有8種基因多態位點，其中PAI-1基因轉錄起始位點上游-675位點存在單個鳥嘌呤的缺失或插入，導致PAI-1基因存在3種多態性。研究顯示，4G/5G基因多態性是決定血漿PAI-1水平主要基因因素[8]；且研究[9～13]報道指出PAI-1基因4G/5G基因多態性與哮喘之間存在風險關系，其中4G/4G基因型可被定義為哮喘的潛在易感基因型。本研究結果亦證明，PAI-1基因4G/4G為老年哮喘患者易感基因型。

STAT2基因的編碼位于12號染色體長臂(q13.2)，全長18 kb，是STAT蛋白家族成員之一，其編碼的蛋白質相對分子質量為113 kDa。STAT蛋白家族成員STAT1a與細胞因子相關受體結合后被磷酸化，形成二聚體被轉移到細胞核，在細胞內發揮轉錄激活子的作用[14]。在抗原因子刺激下，STAT2被有抗炎、抗病毒、調節免疫促分化作用的IFN-α和IFN-β活化[15]，并與發生磷酸化的STAT1結合形成二聚體，通過JAK-STAT信號通路發揮生物學作用[16]，可影響Th2細胞分化，進一步誘導IgE分泌和嗜酸性粒細胞浸潤，促進哮喘發生。有文獻[17]表明，STAT1蛋白的過量活化會有助于其依賴基因細胞間黏附因子1的過量表達，促進NO的產生，進一步加重氣道炎癥和氣道高反應，為哮喘提供分子基礎。阻斷STAT2信號轉導可抑制血管內皮生長因子及堿性成纖維生長因子誘導的血管內皮細胞增殖及遷移、微血管增生，而在哮喘氣道重構過程中，血管內皮細胞增殖及微血管增生是必不可少的[18]。目前STAT2單基因對哮喘病的影響仍存在爭議，Hsieh等[19]對117例臺灣哮喘病兒童進行STAT2基因、CD40基因、TLR4基因多態性檢測，結果顯示STAT2基因的CG基因型與C等位基因與哮喘發病有關聯,攜帶C等位基因型的個體哮喘風險高于G等位基因型6倍，而與其他基因的多態性無關聯。但也有文獻[20]報道，STAT2基因與哮喘無關聯。本研究中哮喘組與對照組STAT2基因多態位點基因型和等位基因頻率分布差異無統計學意義，STAT2基因多態性與老年哮喘的關聯性不密切，其研究結果的不一致可能與地區受限以及樣本量過小有關。同時，哮喘為多個致病基因共同作用的結果，并非是單基因病，因此單基因的作用可能相對較小。

哮喘患者的支氣管平滑肌細胞、炎性細胞可在體外產生大量PAI-1，抑制纖溶酶的分裂作用，導致轉化生長因子β1釋放減量，誘導平滑肌細胞合成膠原[21]。在疾病狀態下，PAI-1促進血管的形成[22],而STAT2參與信號轉導通路后同樣有使微血管增生的作用；同時STAT2可誘導嗜酸性粒細胞浸潤，而PAI-1與肥大細胞、嗜酸性粒細胞可形成復雜的參與氣道重塑的調節網絡。二者可相互促進使人體發生哮喘或加重哮喘。本研究的STAT2基因、PAI-1基因聯合檢測結果示PAI-1基因型為4G/4G且STAT2基因型為GG個體發生哮喘的風險比其他聯合基因型增加2.22倍，表明STAT2基因和PAI-1基因在老年哮喘發病上具有協同作用。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.016

R725

B

1002-266X(2017)38-0053-04

李峰(E-mail： 13963678789@163.com)

2017-02-19)