LSD1、NDRG1基因沉默對人卵巢癌SKOV3細胞遷移能力的影響及兩者的關系

邵根寶，王冉冉，魏野，金潔，張柳平

(江蘇大學醫學院，江蘇鎮江 212013)

LSD1、NDRG1基因沉默對人卵巢癌SKOV3細胞遷移能力的影響及兩者的關系

邵根寶，王冉冉，魏野，金潔，張柳平

(江蘇大學醫學院，江蘇鎮江 212013)

目的觀察賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1)、N-myc下游調節基因1(NDRG1)基因沉默對人卵巢癌SKOV3細胞遷移能力的影響，并探討兩者的作用關系。方法取人卵巢癌SKOV3細胞株，通過shRNA方法建立誘導型干擾LSD1的SKOV3細胞株(LSD1-shRNA-SKOV3)，將其分為對照組、Dox組、轉染組和聯合組。對照組用水處理，Dox組用100 ng/mL Dox處理，轉染組轉染NDRG1 siRNA，聯合組轉染NDRG1 siRNA的同時加入100 ng/mL Dox處理。采用實時熒光定量PCR和Western blotting法分別檢測4組LSD1、NDRG1基因mRNA和蛋白表達；染色質免疫沉淀ChIP法和實時熒光定量PCR法分析對照組和Dox組NDRG1基因啟動子區組蛋白H3第4位賴氨酸的二甲基化(H3K4me2)程度；Transwell小室測算4組細胞遷移率。結果Dox組、轉染組、聯合組、對照組LSD1 mRNA表達分別為0.407±0.029、0.936±0.024、0.413±0.018、0.941±0.035，蛋白表達分別為0.306±0.013、0.879±0.036、0.341±0.057、0.893±0.052，Dox組、聯合組與對照組相比，P均<0.05。Dox組、轉染組、聯合組、對照組NDRG1 mRNA表達分別為0.791±0.045、0.107±0.016、0.165±0.021、0.239±0.027，蛋白表達分別為0.907±0.005、0.130±0.006、0.216±0.019、0.358±0.062，Dox組、轉染組、聯合組與對照組相比，聯合組與Dox組、轉染組相比，P均<0.05。Dox組、對照組細胞NDRG1基因啟動子區H3K4me2水平分別為3.32±0.41、0.83±0.17，兩組相比P<0.01。Dox組、轉染組、聯合組、對照組細胞遷移率分別為21.75%±1.816%、79.13%±2.561%、40.13%±2.039%、68.91%±3.167%，Dox組、轉染組、聯合組與對照組相比，聯合組與Dox組、轉染組相比，P均<0.05。結論LSD1基因沉默人卵巢癌SKOV3細胞遷移能力降低，NDRG1基因沉默人卵巢癌SKOV3細胞遷移能力升高；LSD1通過降低NDRG1基因啟動子區域H3K4me2水平，抑制NDRG1的表達，從而促進卵巢癌SKOV3細胞轉移。

賴氨酸特異性去甲基化酶1；N-myc下游調節基因1；表觀遺傳調控；細胞遷移；卵巢腫瘤

賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1)，又名KDM1A、AOF2和BHC110，是2004年發現的第一個組蛋白去甲基化酶。LSD1屬于黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性胺氧化酶，它能夠特異性催化組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4)或H3K9位點的去甲基化，參與染色質結構的重塑進而影響基因的轉錄調控[1]。LSD1通過異常的基因表達調控，在腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移等方面發揮著重要的作用，是一個潛在的干預腫瘤惡性轉化的靶點[2]。近期本課題組研究表明，LSD`在卵巢癌細胞中高表達，敲低LSD1表達可以抑制卵巢癌細胞轉移[3]。然而，LSD`在卵巢癌細胞轉移中的作用機制尚不清楚。研究發現，N-myc下游調節基因`>(NDRG`)基因可抑制前列腺癌[4]和結直腸癌[5]細胞侵襲和轉移，提示該基因可作為一個候選的腫瘤轉移抑制基因。NDRG`在腫瘤細胞中的低表達會激發腫瘤細胞轉移已成為共識，但其低表達的分子機制并不清楚。2015年9月～2017年3月，本研究觀察了LSD1、NDRG1基因沉默對人卵巢癌SKOV3細胞遷移能力的影響，并探討兩者的作用關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RNA提取試劑TRIzol和Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；染色質免疫沉淀(ChIP)試劑盒購自美國Millipore公司；PrimeScript RT Reagent Kit逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；多西環素(Dox)購自美國Sigma公司；兔抗人LSD1多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；兔抗人NDRG1多克隆抗體購自abcam公司；鼠抗人組蛋白H3K4的二甲基化(H3K4me2)單克隆抗體購自美國Upstate公司；兔抗人α-tubulin單克隆抗體購自美國Bioworld Technology公司。慢病毒表達質粒pLKO-Tet-On、pHR′-CMV-8.2ΔVPR和pHR′-CMV-VSVG由美國普渡大學Changdeng Hu教授惠贈。DMEM細胞培養基、胰酶、抗生素均購自美國Gibco公司；胎牛血清購自ExCell Bio公司。

1.2 細胞培養、轉染及處理 人卵巢癌SKOV3細胞株由江蘇大學邵啟祥教授饋贈。將SKOV3細胞培養于含10%胎牛血清(FBS)和抗生素(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)的DMEM培養液中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中常規培養、傳代。待細胞生長至70%～80%融合時，提取細胞用于實驗。使用質粒大量抽提試劑盒提取重組質粒pLKO-Tet-On-shLSD1、pHR′-CMV-8.2ΔVPR和pHR′-CMV-VSVG，應用Lipofectamine2000轉染試劑進行細胞轉染，于轉染24、48、72 h后收集慢病毒上清液。用慢病毒上清液感染SKOV3細胞，之后用1.5 μg/mL puromycin篩選1～2周，直至篩選出穩定感染LSD1-shRNA的SKOV3細胞株(LSD1-shRNA-SKOV3)[6,7]。將LSD1-shRNA-SKOV3細胞分為對照組、Dox組、轉染組和聯合組。對照組用水處理、Dox組用100 ng/mL Dox處理(誘導LSD1基因沉默)、轉染組轉染NDRG1 siRNA (沉默NDRG1基因)、聯合組轉染NDRG1 siRNA的同時用100 ng/mL Dox處理(沉默LSD1和NDRG1基因)，各組細胞處理24 h或48 h后用于下述實驗。

1.3 細胞LSD1、NDRG1 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。取1.2中培養48 h后4組細胞，用TRIzol試劑盒提取各組細胞總RNA，取2 μg RNA，按PrimeScript RT Reagent Kit逆轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板，利用SYBR-Green PCR Master Mix試劑盒進行PCR擴增。以GAPDH為內參基因，設計并合成引物。LSD1基因上游引物5′-CAAGTGTCAATTTGTTCGGG-3′，下游引物5′-TTCTTTGGGCTGAGGTACTG-3′，產物218 bp；NDRG1基因上游引物5′-GGGCTGAAAAGCATTATTGG-3′，下游引物5′-CTCCACCATCTCAGGGTTGT-3′，產物87 bp；GAPDH基因上游引物5′-GCAAATTCCATGGCACCGTC-3′，下游引物5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′，產物106 bp。PCR反應條件：95 ℃ 30 s，1個循環；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s 循環40次。以2-ΔΔCt法計算并表示細胞LSD1、NDRG1 mRNA相對表達量。實驗重復3次取平均值。

1.4 細胞LSD1、NDRG1蛋白檢測 采用Western blotting法。取1.2中培養48 h后4組細胞，用細胞和組織蛋白提取試劑盒(康成生物科技公司)，并添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(羅氏公司)的裂解緩沖液裂解細胞。細胞裂解液在冰上孵育20 min，期間要旋渦振蕩4次，每次15 s，然后以14 000 g、4 ℃離心20 min，結束后取上清液，用BCA法測定蛋白濃度[3,8]。取40 μg總蛋白于120 V電壓下恒壓電泳1～2 h，300 mA恒流轉膜1～2.5 h后，用含5%脫脂奶粉的TBST在室溫下封閉轉移膜1 h。將膜和稀釋的一抗LSD1(1∶1 000)、H3K4me2(1∶500)、NDRG1(1∶1 200)和α-tubulin(1∶1 000)，在4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3次后，將膜與辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1∶1 000)于室溫下反應1 h，用TBST洗膜3次，ECL化學發光法顯色，凝膠系統成像。以α-tubulin作為內參，采用Image J軟件分析特異性蛋白條帶灰度值。

1.5 NDRG1基因啟動子區H3K4me2水平檢測 采用ChIP法和實時熒光定量PCR法。將對照組和Dox組細胞培養48 h后，在兩組細胞中添加18.5%甲醛，使其終濃度為1%，室溫靜置10 min，收集細胞至1.5 mL離心管中，720 g、4 ℃離心5 min。將細胞重懸于500 μL含2.5 μL Cocktail Ⅱ的Lysis Buffer中進行超聲，之后13 000 g、4 ℃離心10 min，取上清。在200 μL上清中加入900 μL含4.5 μL Cocktail Ⅱ Dilution Buffer，加60 μL Protein G Agarose，5 000 g、4 ℃離心1 min，轉移上清至新的1.5 mL離心管。然后在其中加入H3K4me2抗體，4 ℃旋轉混勻過夜，再加60 μL Protein G Agarose，4 ℃旋轉混勻1 h，5 000 g、離心1 min，棄上清，沉淀經Wash Buffer清洗3次。在沉淀中添加200 μL Elution Buffer，室溫靜置15 min，5 000 g、離心1 min，取上清液。在上清中加入8 μL 5 mol/L NaCl，于65 ℃水浴中孵育4～5 h或過夜，加1 μL RNase A，于37 ℃水浴中孵育30 min，以分離DNA。然后在其中添加1 mL Bind Reagent A，隨后將其轉移至收集管，14 000 g、離心30 s，棄去收集管，把濾器放進新的收集管，加50 μL Elution Buffer C，14 000 g、離心30 s，最后保存DNA。利用實時熒光定量PCR法檢測DNA量。

1.6 細胞體外遷移能力觀察 采用Transwell小室檢測。取1.2中培養24 h后4組細胞，胰酶消化成細胞懸液，調整細胞密度為1.5×105/mL。取300 μL細胞加入Transwell上室，下室中加入500 μL含10% FBS的DMEM培養液，繼續培養24 h后取出小室。用Giemsa染色液對遷移的細胞染色15 min，結束后以濕棉簽輕輕擦去膜上細胞，封固。每張膜中間部分和周圍部分各隨機取5個視野，光學顯微鏡下(100×)計數每個視野內的細胞數，取其平均值。以遷移細胞數除以小室的總細胞數，計算相對遷移率。

2 結果

2.1 各組細胞LSD1、NDRG1 mRNA及蛋白表達比較 見表1。

表1 各組細胞LSD1、NDRG1 mRNA及蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與Dox組、轉染組比較，#P<0.05。

2.2 Dox組、對照組NDRG1基因啟動子區H3K4me2水平比較 Dox組、對照組細胞NDRG1基因啟動子區H3K4me2水平分別為3.32±0.41、0.83±0.17，兩組相比P<0.01。

2.3 各組細胞遷移率比較 Dox組、轉染組、聯合組、對照組細胞遷移率分別為21.75%±1.816%、79.13%±2.561%、40.13%±2.039%、68.91%±3.167%，Dox組、轉染組、聯合組與對照組相比，聯合組與Dox組、轉染組相比，P均<0.05。

3 討論

LSD1是最早發現的組蛋白去甲基化酶，其已被證實涉及腫瘤的多個病理過程，包括腫瘤的發生、增殖、分化和轉移[9]。Schulte等[10]發現，LSD1與成神經細胞瘤分化密切相關，低分化的成神經細胞瘤中LSD1高表達，應用RNA干擾技術抑制LSD1表達后，腫瘤細胞的生長受到明顯抑制；體內實驗進一步證實，沉默LSD1可以抑制成神經細胞瘤的生長。Lv等[11]發現，過量表達LSD1可以促進非小細胞肺癌的增殖，改變細胞周期分布，增強肺癌侵襲和轉移能力。然而，LSD1在卵巢癌中作用及機制的研究還很少。本研究中的基因干擾方法采用四環素(Tet)-On基因表達系統，是目前認為最理想的真核生物基因表達系統，具有特異性、高效性及可調控性等優點。該系統由2種表達質粒組成，調節質?？杀磉_1種融合蛋白，稱為Tet反應轉錄活化因子，該因子可與反應轉錄的Tet反應元件結合，在Tet或其衍生物Dox存在的情況下，引起插入啟動子下游的目的基因高效表達；無Tet/Dox存在情況下，基因表達被抑制。本研究結果顯示，與對照組比較，Dox組、聯合組細胞LSD1 mRNA和蛋白表達減少，轉染組、聯合組NDRG1 mRNA和蛋白表達降低，表明細胞模型構建成功可用于后續實驗。此外，Dox組NDRG1 mRNA和蛋白表達較對照組顯著增加，表明沉默LSD1基因可以上調NDRG1基因表達。

LSD1作為組蛋白去甲基化酶，主要通過調節組蛋白H3K4或H3K9的甲基化修飾影響基因的轉錄[12]。LSD1可以直接與靶基因啟動子區域結合，引起H3K4去甲基化，從而導致基因轉錄抑制。本研究通過染色質免疫沉淀分析發現，LSD1能夠結合NDRG1基因的啟動子，與對照組比較，Dox組NDRG1基因的啟動子區H3K4甲基化水平顯著增加。這表明干擾LSD1表達可以增加NDRG1基因啟動子區H3K4的甲基化，從而促進NDRG1的表達，提示NDRG1是LSD1下游的一個靶基因。

LSD1對腫瘤細胞侵襲和轉移的作用是通過復雜的信號通路完成的。TGF-β/NDRG1信號通路與惡性腫瘤生長、轉移密切相關，LSD1通過與TGF-β下游靶基因的啟動子結合，調控靶基因的表達，激活TGF-β信號，最終促進細胞增殖、侵襲和轉移。此外，LSD1可以介導MYCN基因對NDRG1的抑制，從而促進神經母細胞瘤侵襲和轉移。因此，推測LSD1可能通過TGF-β/NDRG1信號通路參與對腫瘤細胞生物學行為的調節。本研究結果顯示，與對照組比較，Dox組細胞遷移率降低，而轉染組細胞遷移率升高，這表明沉默LSD1基因可以抑制SKOV3細胞轉移，干擾NDRG1表達促進SKOV3細胞轉移。同時，聯合組的細胞遷移率較Dox組高、轉染組低，表明干擾NDRG1表達能夠逆轉LSD1基因沉默誘導的細胞轉移抑制。提示LSD1可能通過抑制NDRG1基因的表達來促進卵巢癌細胞轉移，靶向LSD1和TGF-β/NDRG1信號通路之間的聯系可作為一種可行的方法來治療侵襲性卵巢癌。

綜上所述，LSD1通過降低NDRG1基因啟動子區域H3K4me2水平，抑制NDRG1的表達，從而促進卵巢癌SKOV3細胞轉移。

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EffectsofsilencingLSD1andNDRG1onmigrationofSKOV3ovariancancercells

SHAOGenbao,WANGRanran,WEIYe,JINJie,ZHANGLiuping

(SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China)

ObjectiveTo observe the effects of silencing lysine specific demetylase 1 (LSD1) and N-myc downstream regulated gene 1 (NDRG1) on cell migration of ovarian cancer cells SKOV3 and to investigate the correlation between them.MethodsStable shRNA knockdown technique was employed to generate an inducible and stable SKOV3 cell line expressing tetracycline-regulated shRNA against LSD1 (LSD1-shRNA-SKOV3). The LSD1-shRNA-SKOV3 cells were divided into the control group, Dox group, transfection group, and co-treatment group. Cells in the control group were treated with water, cells in the Dox group were treated with 100 ng/mL Dox, cells in the transfection group were transfected with NDRG1 siRNA, and cells in the co-treatment group were transfected with NDRG1 siRNA and were added with 100 ng/mL Dox at the same time. The mRNA and protein levels of LSD1 and NDRG1 genes in these cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting, respectively. The histone H3 lysine 4 dimethylation (H3K4me2) levels in the promoter region of NDRG1 gene were measured by chromatin immunoprecipitation (ChIP). The cell migration rate was calculated by the Transwell chamber assay.ResultsThe mRNA levels of LSD1 were 0.407±0.029, 0.936±0.024, 0.413±0.018, and 0.941±0.035, and its protein levels were 0.306±0.013, 0.879±0.036, 0.341±0.057, and 0.893±0.052 in the Dox group, transfection group, co-treatment group, and control group, respectively.Compared with the control group, the mRNA and protein levels of LSD1 decreased in the Dox and co-treatment groups (allP<0.05). The mRNA levels of NDRG1 were 0.791±0.045, 0.107±0.016, 0.165±0.021, and 0.239±0.027, and its protein levels were 0.907±0.005, 0.130±0.006, 0.216±0.019, and 0.358±0.062 in the Dox group, transfection group, co-treatment group, and control group, respectively. Compared with the control group, NDRG1 mRNA and protein levels significantly changed in the Dox group, transfection group and co-treatment group (allP<0.05). The levels of H3K4me2 in the promoter of NDRG1 gene were up-regulated in the Dox group as compared with that of the control group (3.32±0.41 vs. 0.83±0.17;P<0.01). Compared with the control group (68.91%±3.167%), the migration rate decreased in the Dox group (21.75%±1.816%) and co-treatment group (40.13%±2.039%), but increased in the transfection group (79.13%±2.561%, allP<0.05). Furthermore, compared with the Dox group and transfection group, the migration rate significantly changed in the co-treatment group (allP<0.05).ConclusionsLSD1 gene silencing decreases the migration ability of human ovarian cancer SKOV3 cells, and the NDRG1 gene silencing increases the migration ability of human ovarian cancer SKOV3 cells. LSD1 can mediate the decrease of H3K4me2 levels in the promoter of NDRG1 gene, down-regulate the expression levels of NDRG1, and consequently promote the migration of ovarian cancer SKOV3 cells.

lysine specific demetylase 1; N-myc downstream regulated gene 1; epigenetic regulation; cell migration; ovarian neoplasms

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.006

R737.31

A

1002-266X(2017)38-0019-04

國家自然科學基金資助項目(81170573)。

邵根寶(1972-)，男，博士研究生，副教授，主要研究方向為生殖細胞與腫瘤的表觀遺傳調控。E-mail: gbshao07@ujs.edu.cn

2017-05-09)