銀翹柴黃顆粒質(zhì)量控制方法研究

張麗先 王學(xué)方 曹靜亞 李曉 李自紅 李飛飛 李智寧 寧二娟 宋夢嬌 魏悅

摘要：目的 建立銀翹柴黃顆粒質(zhì)量控制方法。方法 采用薄層色譜法鑒別銀翹柴黃顆粒中金銀花、柴胡、黃芩及甘草，HPLC測定連翹酯苷A的含量。結(jié)果 在選定的色譜條件下，薄層色譜斑點(diǎn)清晰、分離度好，陰性對照未見干擾。含量測定連翹酯苷A在0.029 6～0.474 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為99.73%，RSD=1.18%。結(jié)論 本方法準(zhǔn)確、簡便，能夠有效控制銀翹柴黃顆粒的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：銀翹柴黃顆粒；質(zhì)量控制；薄層色譜法；高效液相色譜法；含量測定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.020

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）11-0082-04

Study on Quality Control Method of Yinqiao Chaihuang Granules ZHANG Li-xian1，2， WANG Xue-fang2，3， CAO Jing-ya1，2， LI Xiao2，3， LI Zi-hong1，2， LI Fei-fei1，2， LI Zhi-ning1，2， NING Er-juan1，2， SONG Meng-jiao1，2， WEI Yue1，2 （1. Cogotesting International Company Limited， Zhengzhou 450000， China； 2. Biological Developing Center of Henan， Zhengzhou 450000， China； 3. Henan Plant Natural-Products Development Engineering Technology Company， Zhengzhou 450002， China）

Abstract： Objective To establish the quality control method of Yinqiao Chaihuang Granules. Methods Lonicerae Japonicae Flos， Bupleuri Radix， Scutellariae Radix and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma in Yinqiao Chaihuang Granules were identified by TLC， and the content of forsythoside A was detected by HPLC. Results Under the selected chromatographic conditions， TLC spots were clear， the separating was good， and non-interference was found in negative control. Forsythoside A in calibration curve showed good linearity in the range of 0.029 6–0.474 ?g， with average recovery of 99.73%， RSD=1.18%. Conclusion The method is accurate and simple， which can be used for the quality control of Yinqiao Chaihuang Granules.

Key words： Yinqiao Chaihuang Granules； quality control； TLC； HPLC； content determination

銀翹柴黃顆粒是基于銀翹散辛涼透表、清熱解毒的功效和小柴胡湯和解少陽、和胃降逆的功效[1-2]，通過不同藥味間合理加減、調(diào)劑組方制備而成的顆粒劑。該方劑由連翹、金銀花、柴胡、黃芩、甘草等7味中藥組成，具有清熱、抗炎、抑菌、抗感染、抗氧化、抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛的功效。連翹作為君藥，用量較大，連翹酯苷A為連翹中含量較高的主要活性成分之一，具有與復(fù)方制劑相似的功效，如抗氧化、抗菌、抗感染、解熱等[3-4]。

該制劑藥味眾多，成分復(fù)雜，為更好地控制銀翹柴黃顆粒的質(zhì)量一致性，保證用藥安全有效，本試驗(yàn)采用薄層色譜法對銀翹柴黃顆粒復(fù)方制劑中金銀花、柴胡、黃芩和甘草進(jìn)行定性鑒別，同時(shí)采用HPLC對

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（152102110115）

銀翹柴黃顆粒制劑中主要有效成分連翹酯苷A進(jìn)行定量測定，結(jié)合定性鑒別和含量測定建立銀翹柴黃顆粒質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津），KH5200型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），ME-204型微量分析天平（賽多利斯公司），YELA SB-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司），HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），Good-See-20E上海科哲成像系統(tǒng)。

3批銀翹柴黃顆粒（批號(hào)20140801、20140802、20140803，依次編號(hào)為1、2、3），河南省科高植物天然產(chǎn)物開發(fā)工程技術(shù)有限公司提供。對照藥材金銀花（批號(hào)121060-201208）、黃芩（批號(hào)120955-201309）、柴胡（批號(hào)120992-201209）、甘草（批號(hào)120904- 201319），中國食品藥品檢定研究院；對照品綠原酸（批號(hào)110753-200413）、黃芩苷（批號(hào)110715- 200815）、柴胡皂苷a（批號(hào)110831-200302）、柴胡皂苷d（批號(hào)110778-200506）、甘草苷（批號(hào)111610- 201106）、連翹酯苷A（批號(hào)111810-201001），中國食品藥品檢定研究院；硅膠G板、硅膠H板及聚酰胺板，青島海洋化工廠；乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 金銀花 分別取本品0.5 g，加甲醇15 mL，放置12 h，過濾，濾液作為供試品溶液，編號(hào)為1～3。另取金銀花對照藥材及按處方工藝制成的不含金銀花的樣品，同上法制成對照藥材溶液、陰性供試液。再取綠原酸對照品10 mg，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各6 ?L，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置365 nm紫外光燈下檢視。3批供試品色譜中在與綠原酸對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色熒光斑點(diǎn)。在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯3個(gè)相同顏色的斑點(diǎn)，供試品平行性良好，陰性供試液無干擾。

2.1.2 黃芩 分別取本品1 g，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1）的混合溶液30 mL，加熱回流30 min，放冷，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，上清液作為供試品溶液，編號(hào)為1～3。另取黃芩對照藥材及按處方工藝制成的不含黃芩的樣品，同法制成對照藥材溶液、陰性供試液。再取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各2 ?L，點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以36%醋酸溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%FeCl3乙醇溶液，分別置日光和365 nm紫外光燈下檢視。3批供試品色譜和黃芩苷對照品及對照藥材色譜相應(yīng)的位置顯相同的暗色斑點(diǎn)，黃芩苷分離度欠佳，供試品平行性良好，陰性供試液有干擾。

2.1.3 柴胡 分別取本品1 g，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，放冷，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液50 mL洗滌1次，再用正丁醇飽和的水50 mL洗滌1次，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液，編號(hào)為1～3。另取柴胡對照藥材及按處方工藝制成的不含柴胡的樣品，同法制成對照藥材溶液、陰性供試液。再取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d對照品，分別加甲醇制成每1 mL含柴胡皂苷a 0.5 mg、柴胡皂苷d 0.5 mg的對照品溶液，另配制每1 mL含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d各0.5 mg的混合對照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各2 ?L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（8∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置365 nm紫外光燈下檢視。3批供試品色譜在對照藥材、對照品顯色位置處顯相同顏色斑點(diǎn)，其中柴胡皂苷d顯色明顯，柴胡皂苷a色彩暗淡，供試品平行性良好，陰性供試液無干擾。

2.1.4 甘草 分別取本品1 g，加乙醚40 mL，加熱回流1 h，過濾，棄去乙醚液，藥渣加甲醇30 mL，加熱回流1 h，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液，編號(hào)為1～3。另取甘草對照藥材及按處方工藝制成的不含甘草的樣品，同法制成對照藥材溶液和陰性供試液。再取甘草苷對照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各2 ?L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置365 nm紫外光燈下檢視。3批供試品色譜中，與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，供試品平行性良好，陰性供試液無干擾。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 采用Venusil XBP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），以乙腈-0.5%醋酸水溶液（15∶85）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長330 nm，進(jìn)樣量10 ?L。色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取連翹酯苷A對照品7.4 mg，以70%甲醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，得濃度為296 ?g/mL的連翹酯苷A對照品溶液（臨用新制）。

2.2.3 供試品溶液的制備 取銀翹柴黃顆粒0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率400 W，頻率40 kHz）10 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。將供試品溶液過0.22 ?m微孔濾膜，置于1.5 mL進(jìn)樣小瓶中，待液相分析。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取除連翹外的其余藥味，按工藝要求制成不含連翹的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取連翹酯苷A對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，70%甲醇定容，搖勻。在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得連翹酯苷A的線性方程Y=1555750X-6632.1，r2=0.999 9。連翹酯苷A在0.029 6～0.474 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取濃度為11.84 ?g/mL的對照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD=0.76%，表明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于制樣后0、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果連翹酯苷A含量RSD=1.25%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測，連翹酯苷A的平均含量為0.67%，RSD=1.62 %，表明本法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取樣品6份，每份準(zhǔn)確稱取0.1 g，加入一定量的連翹酯苷A對照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

3 討論

參照藥典方法[5]221能夠?qū)崿F(xiàn)銀翹柴黃顆粒中金銀花的鑒別，綠原酸分離度良好。黃芩的薄層鑒別方法眾多，藥典以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）為展開劑[5]301，謝東等[6]以乙酸為展開劑，其中以36%醋酸展開后斑點(diǎn)明顯，黃芩苷分離度較其他方法有提高，但仍然未能實(shí)現(xiàn)黃芩苷與鄰近斑點(diǎn)完全分離，拖尾現(xiàn)象依然明顯，陰性供試液在黃芩苷顯色處有干擾，故黃芩的薄層鑒別有待進(jìn)一步研究。雜質(zhì)對于柴胡的鑒別干擾嚴(yán)重，通過優(yōu)化前處理方法[7]，提高供試液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的純度，有效改善了分離效果，柴胡皂苷d顯色明顯，可將其作為柴胡鑒別的對照品。藥典以甘草酸銨作對照品為甘草鑒別的方法[5]87對本處方不適用，本試驗(yàn)以甘草苷作為甘草鑒別的對照品，供試品溶液與對照品、對照藥材顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性供試液未見干擾。

本試驗(yàn)對于連翹酯苷A含量測定，考察了不同比例甲醇對連翹酯苷A的溶出度。流動(dòng)相選擇方面，比較了甲醇-水、乙腈-水、不同比例對乙酸對連翹酯苷A分離度及色譜峰對稱性的影響。最終選擇70%甲醇為提取溶劑，乙腈-0.5%乙酸為流動(dòng)相，通過一系列的方法學(xué)考察以及樣品測定表明本方法穩(wěn)定可靠。

本試驗(yàn)通過銀翹柴黃顆粒中多味中藥的定性鑒別，避免了單一藥味鑒別的片面性，較好實(shí)現(xiàn)了對復(fù)方制劑的全面把控，同時(shí)結(jié)合銀翹柴黃顆粒中活性成分連翹酯苷A含量測定方法，能夠?qū)︺y翹柴黃顆粒的質(zhì)量進(jìn)行有效控制。

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