不同條件下韭菜汁對茶樹輪斑病孢子萌發(fā)的抑制活性研究

劉彥+張冬蓮+呂金麗+周鵬+胡秋舲

摘 要：茶輪斑病是貴州茶園主要病害之一；在國家茶園“雙減”戰(zhàn)略背景下，急需研發(fā)安全、高效、低毒的防治茶輪斑病天然產(chǎn)物源農(nóng)藥。本文采用凹玻片加入法，研究了不同溫度、不同pH影響因素下，韭菜汁對茶輪斑病孢子萌發(fā)的抑制作用，以確定韭菜汁在不同條件下對茶輪斑病菌的抑制活力。結(jié)果表明，在試驗(yàn)的不同溫度條件下，濃度為2%的韭菜莖汁和葉汁對茶輪斑病均有抑制作用，且抑制率達(dá)100%。在試驗(yàn)的不同pH條件下，濃度為2%的韭菜根汁對茶輪斑病菌的抑制作用相同，均為100%，而莖汁對茶輪斑病菌的抑制作用依次為pH5 = pH6 = pH7 > pH8 > pH9。本研究說明了韭菜汁防治茶輪斑病的可能性，為茶園植物源抗病藥劑的創(chuàng)制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：韭菜；茶輪斑病菌；孢子萌發(fā)；溫度

茶樹病害發(fā)生時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，其中茶樹輪斑病（Pestalotiopsis theae （Sawada）Steyaert）在我國茶區(qū)分布廣泛[2， 3]，也是貴州茶園中一種在嫩葉、成葉、老葉均可發(fā)病的葉部病害，秋季發(fā)生尤重。病重年份，可引致茶樹大量落葉，致使樹勢衰弱，嚴(yán)重影響次年春茶萌發(fā)，導(dǎo)致產(chǎn)量下降。但目前對其防治手段有限：當(dāng)前茶園常用的化學(xué)殺菌劑不僅嚴(yán)重影響茶葉質(zhì)量安全，而且存在一定毒性、污染環(huán)境、易引起抗藥性等問題，因此，急需研發(fā)安全、高效、低毒的防治茶樹輪斑病天然產(chǎn)物源農(nóng)藥。由于其源于自然，具有無毒或低毒，對人畜安全，且不易產(chǎn)生抗性，不僅安全，而且可以達(dá)到殺菌抗病的功效。韭菜（Allium tuberosum）為百合科蔥屬多年生草本植物，全國各地皆產(chǎn)的蔬菜，有多種藥用功能，有學(xué)者對韭菜進(jìn)行了抗植物病原菌研究，但是其對茶樹輪斑病的研究未見報(bào)道[7-11]。本文通過研究不同溫度、不同pH值條件下，韭菜汁對茶樹輪斑病孢子萌發(fā)的抑制作用，韭菜功能成分的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)，為茶樹輪斑病的防治提供新方法。

一、材料與方法

1.材料

（1）供試孢子。茶樹輪斑病病原菌由貴州省茶葉研究所提供。將茶樹輪斑病菌接種在PDA培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)1周后，用PDA培養(yǎng)液的稀釋液洗下孢子，四層紗布過濾后，配成105/mL的孢子懸浮液。

（2） 供試植物。韭菜采自六盤水農(nóng)戶菜田。

2.方法

（1）韭菜汁液的制備。將新鮮韭菜洗凈、晾干，稱取其根、莖基部、葉各5 g，在75%酒精中表面消毒1 min，再在0.1%升汞中表面消毒1 min，用無菌水沖洗3次后置于無菌研缽中充分研磨，研出液為韭菜原汁（100%），然后用雙蒸水按比例配成2%的供試液。

（2）不同溫度下韭菜汁對茶樹輪斑病菌孢子萌發(fā)抑制活性研究。將韭菜莖、葉汁配成2%濃度，茶樹輪斑病菌配成105/mL 的孢子懸浮液，按韭菜汁：茶樹輪斑病原菌孢子懸浮液2：1的比例配成混合液滴加于凹玻片上，相同比例的清水作對照，分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的培養(yǎng)箱中，保濕培養(yǎng)24 h后觀察孢子的萌發(fā)情況。每個(gè)處理隨機(jī)觀察500個(gè)孢子，做3次重復(fù)。

孢子萌發(fā)抑制率（%）=（對照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）/對照萌發(fā)率×100

（3）不同pH值下韭菜汁對茶樹輪斑病菌孢子萌發(fā)抑制活性研究。將韭菜莖、根汁配成2%濃度，后用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液及無菌水分別配成pH 5-9 的溶液，茶樹輪斑病菌配成105/mL 的孢子懸浮液，按韭菜汁溶液：茶樹輪斑病原菌孢子懸浮液 2：1 的比例配成混合液滴加于凹玻片上，相同比例對應(yīng)的pH值水溶液作對照，分別置于28 ℃的培養(yǎng)箱中，保濕培養(yǎng)24 h后觀察孢子的萌發(fā)情況。每個(gè)處理隨機(jī)觀察500個(gè)孢子，作3次重復(fù)。

二、結(jié)果與分析

1.不同溫度下韭菜汁對茶樹輪斑病菌孢子萌發(fā)的抑制活性

不同溫度下韭菜汁對茶樹輪斑病菌孢子萌發(fā)的抑制活性結(jié)果見表1。

從表1可以看出，不同溫度下韭菜葉汁和莖汁對茶樹輪斑病菌孢子萌發(fā)的抑制效果明顯，抑制率均為100%，表明韭菜葉汁和莖汁中起抑制作用的化學(xué)物質(zhì)其活性在該溫度范圍內(nèi)不受影響。從表1也可以看出，在此溫度范圍內(nèi)，常規(guī)條件下培養(yǎng)的茶樹輪斑病菌孢子隨著溫度的升高，該病菌萌發(fā)率上升，尤其在25℃以上的時(shí)候尤為明顯。

2.不同pH值下韭菜汁對茶樹輪斑病菌孢子萌發(fā)的抑制活性

不同pH值下韭菜汁對茶樹輪斑病菌孢子萌發(fā)的抑制活性結(jié)果見表2。

如表2，不同pH值對茶輪班病菌孢子的萌發(fā)有顯著影響。在pH 5-7范圍內(nèi)病原菌孢子萌發(fā)好，pH值在堿性條件下，不利于孢子的萌發(fā)。偏酸性條件有利于茶樹輪斑病病原菌分生孢子的萌發(fā)。不同pH值下，根汁對茶樹輪斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率均為100%，表明根汁對病菌的抑制作用在pH值5-9范圍內(nèi)不受影響。在弱酸性條件下，莖汁對病菌孢子萌發(fā)的抑制率均為100%；而堿性條件下，病菌孢子部分萌發(fā)，表明莖汁對病菌的抑制作用減弱，這可能是由于堿性條件下，莖汁中活性物質(zhì)的可能遭到破壞引起的。

三、討論

茶樹輪斑病的是貴州茶園較普遍發(fā)生的病害，主要為害茶樹的葉片，嚴(yán)重影響茶葉的品質(zhì)和產(chǎn)量。韭菜汁對茶葉輪班病菌孢子的萌發(fā)有極強(qiáng)的抑制作用，研究外在因素對其活性的影響有重要意義。在5℃-35 ℃范圍內(nèi)，濃度為2%的莖汁和葉汁對茶樹輪斑病菌孢子的萌發(fā)抑制率均為100%，表明該溫度范圍對韭菜地上部分的抑菌活性物質(zhì)不受影響。pH值 5-9 條件下，濃度為 2% 的韭菜根汁對病菌孢子萌發(fā)的效果顯著，抑制率均為100%，表明根汁中的抑菌活性物質(zhì)受pH作用的影響小，這為用韭菜汁對茶樹輪斑病菌進(jìn)行農(nóng)業(yè)防治進(jìn)一步提供了理論依據(jù)。但韭菜汁的抑菌機(jī)理、活性成分之間的構(gòu)效關(guān)系尚未研究。下一步將綜合運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用、核磁共振等技術(shù)手段探討活性成分的分子結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系，深化對抑菌機(jī)理研究，為研發(fā)安全、高效、新型的植物源殺菌劑奠定基礎(chǔ)。

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