菌種比濁度與菌含量的關系及其應用

鄧鴻英+謝淑華+衛晉波

摘 要：簡介比濁法和活菌計數法測定菌液濃度的操作步驟和優缺點，將比濁法與活菌計數法相結合，測定了常見模式菌株比濁度對應的活菌計數濃度，為菌種濃度的預估提供一個快速，準確，便捷的方法。

關鍵詞：菌液濃度；活菌計數；比濁度

在微生物檢驗工作中，比如藥品微生物限度檢查方法驗證、防腐效力測試、消毒液消毒效果驗證、培養基適用性檢查等等，常常需要加入一定濃度的菌懸液，菌液濃度過高或過低都將影響測試結果的準確性，因此控制菌液濃度是必要且關鍵的一步。測定菌液濃度的方法一般有三種，其一為活菌計數法，此法能準確判斷菌液濃度，是目前國內的仲裁法，但是該法需要培養后計數，有明顯的滯后性；其二為顯微鏡觀察法，該方法適用于菌體較大的菌種濃度的測定，如霉菌和酵母菌，具有方便快捷的優點，但不適用于菌體細小的菌種濃度的測定，有較大的局限性；三為比濁法，此法能快速地判斷菌液濃度，但結果為粗略的估計值，不同大小的菌種其形成的光密度不同，因此同一個比濁度，不同的菌結果差異較大，準確性不高。

本文具體介紹將比濁法和活菌計數法相結合的測定方法，測定了常見模式菌株1麥氏比濁度（MCFARLAND）的菌液濃度，用于指導日常微生物檢測工作中菌液濃度的快速、準確測定，具有較強的實用價值。

一、菌種及菌液的制備

1.菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027）

大腸埃希菌（Escherichia coli ATCC 8739）

枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilisATCC 6633）

乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphiCMCC（B）50094）

白色念珠菌（Candida albicans ATCC 10231）

黑曲霉（Aspergillusniger ATCC 16404）

以上菌種從廣東省微生物菌種保藏中心采購，經復蘇兩代至五代內使用。

2.菌液的制備

（1）將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌的凍干管封口端（即遠離凍干粉的一端）在火焰上分別灼燒后，迅速滴加幾滴滅菌水，使灼燒處管口裂口后，在生物安全柜內用滅菌鑷子輕輕掰開裂口，分別用0.5mL TSB溶解凍干菌種，然后將溶解后的凍干菌株全部轉移到10mL TSB中，置36±1℃恒溫培養箱中培養18～24小時，此為第一代菌種。在生物安全柜內分別用無菌接種環挑取1接種環第一代上述菌懸液分別劃線接種于TSA中然后置于36±1℃恒溫培養箱中培養18～24小時，此為第二代菌種，備用。

（2）將白色念珠菌凍干管封口端在火焰上灼燒后，迅速滴加幾滴滅菌水，使灼燒處管口裂口后，在生物安全柜內用滅菌鑷子輕輕掰開裂口，用0.5mL改良馬丁液體培養基溶解凍干菌種，然后將溶解后的凍干菌株全部轉移到10mL 改良馬丁液體培養基中，置28±1℃恒溫培養箱中培養24～48小時，此為第一代菌種。在生物安全柜內無菌接種環挑取1接種環第一代菌懸液劃線接種于改良馬丁瓊脂培養基中。將新鮮接種的改良馬丁瓊脂培養基置28±1℃恒溫培養箱中培養24～48小時，此為第二代菌種，備用。

（3）將黑曲霉凍干管封口端在火焰上灼燒后，迅速滴加幾滴滅菌水，使灼燒處管口裂口后，在生物安全柜內用滅菌鑷子輕輕掰開裂口，用0.5mL含0.05%吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液溶解凍干菌種，然后將溶解后的凍干菌株劃線接種到改良馬丁瓊脂斜面培養基中，置28±1℃恒溫培養箱中培養5～7天，此為第一代菌種。在生物安全柜內，用無菌接種環挑取1接種環第一代黑曲霉劃線接種于改良馬丁瓊脂斜面培養基中。然后置28±1℃恒溫培養箱中培養5～7天，此為第二代菌種。向第二代黑曲霉菌種管內加入5ml含0.05%吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液，用無菌接種環將孢子洗脫，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管）至無菌試管內，備用。

二、培養基和儀器

1.培養基

（1）商品培養基。

胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）瓶裝顆粒培養基

胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）

改良馬丁液體培養基

改良馬丁瓊脂培養基

0.5%無菌T.T.C

以上培養基從廣東環凱微生物科技有限公司采購商品培養基，按產品說明書配制，滅菌后備用，其中TSA在使用前每100mL培養基加入1mL0.5%無菌T.T.C以便于細菌菌落的觀察。

（2）按配方配制的培養基。

0.85%氯化鈉

0.9%氯化鈉

含0.05%吐溫80的0.9%氯化鈉

以上培養基按配方配制，滅菌后備用。

2.儀器

生物安全柜（型號：SBSC1600ⅡB2）

恒溫培養箱（36±1℃，28±2℃）

麥氏比濁儀（產品貨號：wi114629，生產商：梅里埃）

漩渦混合器（型號：QA-1）

三、菌種比濁度的測定及調節

1.按儀器使用說明書操作，用標準麥氏比濁管檢定儀器，當不同濃度的麥氏比濁管讀數與標準麥氏比濁管標定的值在誤差允許范圍內時，方可進行下一步驟。

2.用0.85%無菌氯化鈉作為空白，調零。

3.分別用無菌接種環挑取1.2.1和1.2.2的平板上菌落適量，分別在裝有5mL 0.85%氯化鈉的50mL錐形瓶瓶壁上將菌分散（蘸取少量氯化鈉后在瓶壁上來回劃線，以便將菌分散后使之易于混勻），然后用漩渦混合器將菌液混勻備用。endprint

4.測定菌液比濁度，用相應菌種的菌落或氯化鈉調節菌液的濃度，使菌液比濁度讀數約為1MCFARLAND。

四、活菌計數法計數各菌種1 MCFARLAND的菌含量

1.金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌在生物安全柜內進行操作。用0.85%無菌氯化鈉作為稀釋劑，10倍梯度逐級稀釋至10-7，分別依次測定每種菌10-5～10-7三個稀釋倍數的菌落數。用移液槍及滅菌移液槍頭各吸取1mL注入滅菌平皿中，每種菌每個梯度制備2個平行。注入約20mL，45℃～50℃的TSA培養基，隨即轉動平皿，使樣品與培養基充分混合均勻，待培養基凝固后，翻轉平皿，置36℃±1℃恒溫培養箱內培養48h，然后進行菌落計數。先用肉眼觀察，必要時可用放大鏡，點計菌落數，記下各平皿的菌落數后，求出每種菌的平均菌落數，換算成每種菌1 MCFARLAND的菌含量。

2.白色念珠菌和黑曲霉在生物安全柜內進行操作，白色念珠菌用0.85%無菌氯化鈉作為稀釋劑，黑曲霉用0.9%無菌氯化鈉作為稀釋劑，10倍梯度逐級稀釋至10-6，每種菌分別測定10-4～10-6三個稀釋倍數的菌落數。用移液槍及滅菌移液槍頭各吸取1mL注入滅菌平皿，每種菌每個梯度制備2個平行。注入約20mL，45℃～50℃的改良馬丁瓊脂培養基，隨即轉動平皿，使樣品與培養基充分混合均勻，待培養基凝固后，翻轉平皿，置28℃±1℃恒溫培養箱內培養72h后，進行菌落計數。先用肉眼觀察，必要時可用放大鏡，點計菌落數，記下各平皿的菌落數后，求出每種菌的平均菌落數，換算成每種菌1 MCFARLAND的菌含量。

五、結果與討論

每種菌獨立重復三次實驗，計算三次重復實驗每種菌1MCFARLAND所含的平均菌落數。結果如下表：

由表1可以看到：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、白色念珠菌以及黑曲霉每1MCFARLAND采用活菌計數法計數所得的菌液含量具有良好的重現性，三次獨立重復實驗測定的菌液含量相對偏差小于50%。菌液的比濁度與菌體的大小有有關，菌體越大，相同比濁度的菌液含量越少。

六、結論

通過本實驗證實，菌液含量（CFU/mL）與菌液的比濁度（MCFARLAND）有良好的相關性，可將實驗用菌懸液調節至1MCFARLAND，通過活菌計數法確定實驗用菌懸液的含量，以便較準確的預估實驗用菌株濃度及所需要稀釋的級別。用平板制備的菌落，可采用適宜的稀釋劑作為比濁儀的空白對照，調零。此方法特別適用于枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞桿菌等在液體培養基上易形成塊狀或絮狀物等不易打散的菌液的計數。若采用液體培養基增菌的菌液則用相應的液體培養基作為比濁儀的空白對照，調零。

由于實驗室間條件差異；培養基產地、批號不同；操作人員與系統誤差等原因，同一菌種比濁度對應的菌液含量會有一定差異，建議在同一實驗室一旦有因素變化，應再重新確定菌種比濁度對應的菌液含量。

參考文獻：

[1]朱艷靜，李宇.測定菌體濃度的簡便方法[J].上海市工業微生物研究所，2002，第36卷第4期：47-49.

[ 2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[ M ].四部.北京：中國醫藥科技出版，2015： 1105.endprint