蛋白激酶C激活對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

陳鐘 鄭曉丹 徐勇

蛋白激酶C激活對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

陳鐘 鄭曉丹 徐勇

目的利用舌癌細(xì)胞系HN12探索激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithe-lial-mesenchymal transition，EMT)的影響。方法采用質(zhì)粒pCMV6-AC-GFP-P120ctn轉(zhuǎn)染HN12細(xì)胞，使HN12過(guò)表達(dá)P120-連環(huán)蛋白(P120-catenin，P120ctn)，再加入蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活劑佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot檢測(cè)PMA處理前后 PKC、P120ctn、E-cad的mRNA和蛋白表達(dá)，通過(guò)Transwell細(xì)胞侵襲及細(xì)胞遷移試驗(yàn)等方法檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果當(dāng)PKC被PMA活化時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞中P120ctn的表達(dá)顯著降低，E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)也隨之降低，間質(zhì)標(biāo)記蛋白N-鈣黏蛋白(N-cadherin，N-cad)和波形蛋白(Vimentin，Vim)的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著提高(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)KC可能通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)P120ctn的表達(dá)，參與細(xì)胞黏附的調(diào)控，促進(jìn)EMT，在口腔鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮作用。

P120-連環(huán)蛋白(P120ctn)； 蛋白激酶C(PKC)； 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)； 口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是胚胎發(fā)育過(guò)程中一種基本的生理現(xiàn)象，以上皮細(xì)胞極性的喪失及運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)為重要特征。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，EMT與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)展、遷移和耐藥性形成等過(guò)程中發(fā)揮了重要的生物作用[1-2]，在口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous-cell cancer，OSCC)細(xì)胞系中多種EMT標(biāo)記物的表達(dá)發(fā)生了上調(diào)或下調(diào)[3]。Wells等[4]發(fā)現(xiàn)EMT最重要的標(biāo)志性變化是E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)的減少或丟失。我們之前的免疫組化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)E-cad在OSCC中的表達(dá)與蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和P120-連環(huán)蛋白(P120-cantenin，Pl20ctn)具有相關(guān)性，且與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移等惡性表型有關(guān)[5]。本試驗(yàn)以舌癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)胞系HN12(具有極強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[6]為研究對(duì)象，探索PKC、Pl20ctn和E-cad在口腔鱗癌細(xì)胞系EMT中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

鼠抗人P120ctn單克隆抗、鼠抗人E-cad單克隆抗體(Abcam,美國(guó))，兔抗人PKC單克隆抗體，pCMV6-AC-GFP- P120ctn(Origene，加拿大)，X-tremeGene HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑(Roche，瑞士)，佛波酯(Sigma，美國(guó))。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS)(Gibco，美國(guó))，TRIzol (Invitrogen，加拿大)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)。CO2培養(yǎng)箱(Thermal，美國(guó))、倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)、熒光PCR儀(Corbett美國(guó))、Transwell小室(Corning，美國(guó))。

1.2 基因轉(zhuǎn)染及篩選

HN12細(xì)胞接種至6 孔板，每孔3×105個(gè)細(xì)胞/2 ml DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h。用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒pCMV6-AC-GFP-P120ctn至1 μg/100 μl，取100 μl加入X-tremeGene HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑3 μl，15～25 ℃孵育30 min，將混合液加入每孔中。37 ℃孵育24 h后，改用含80 μg/ml G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。反復(fù)篩選，收集具有G418抗性的細(xì)胞克隆增殖，命名為HN12/P120ctn。

1.3 PMA激活試驗(yàn)

HN12/P120ctn細(xì)胞加入PKC激活劑佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)，命名為HN12/P120ctn+PMA，使終濃度分別為0、25、50、100 ng/ml。觀察0、24、48、72 h細(xì)胞遷移和侵襲的情況，篩選出最佳分析時(shí)間點(diǎn)和濃度點(diǎn)，并根據(jù)所選出的最佳分析時(shí)間點(diǎn)和濃度點(diǎn)，進(jìn)行PKC、P120ctn、E-cad、N-cad、Vim mRNA和蛋白水平的檢測(cè)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

引物合成委托上海生工生物工程公司完成。用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，進(jìn)行cDNA合成，反應(yīng)體系為Oligo dT primer(50 μmol/L)1 μl，dNTP Mixture 1 μl，Total RNA 5 μg，加入RNase free dH2O 補(bǔ)至10 μl，在PCR儀上進(jìn)行以下條件的反轉(zhuǎn)錄：42 ℃，15 min,70 ℃ 30～60 min。-20 ℃保存。使用熒光PCR儀對(duì)HN4、HN12和HOK細(xì)胞中的P120ctn基因和E-cad基因進(jìn)行定量檢測(cè)，反應(yīng)條件94 ℃、5 min，93 ℃預(yù)變性35 s，56 ℃變性30 s，71 ℃退火60 s，72 ℃延伸7 min，30 個(gè)循環(huán)。

1.5 Western blot

常規(guī)收獲細(xì)胞，提取蛋白上樣，加入瓊脂糖凝膠電泳10 mA 2 h，根據(jù)Marker分子量截取目的條帶，100 V衡壓1 h，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上， 5%的脫脂奶粉封閉后加入一抗4 ℃搖動(dòng)孵育過(guò)夜，充分蕩洗，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育，洗膜曝光。

1.6 Transwell細(xì)胞侵襲及細(xì)胞遷移試驗(yàn)

遷移實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)基和Transwell小室放在37 ℃溫育。消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HN12/P120ctn和HN12/P120ctn+PMA細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/ml，上室加入200 μl細(xì)胞懸液，下室加入800 μl含20%血清的培養(yǎng)，48 h后固定、染色，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。侵襲實(shí)驗(yàn)在Transwell上室底部中央鋪Matrigel膠，后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 HN12/P120ctn、HN12/P120ctn+PMA細(xì)胞形態(tài)的觀察

HN12/P120ctn以多角形細(xì)胞為主，細(xì)胞匯聚成片，HN12/P120ctn+PMA細(xì)胞的表現(xiàn)則為：出現(xiàn)較多梭形細(xì)胞，細(xì)胞大小不等，形態(tài)不規(guī)則，分布較為分散(圖 1)。

圖 1 HN12/P120ctn和HN12/P120ctn+PMA處理后細(xì)胞形態(tài)

Fig 1 The cell morphology treated by HN12/P120ctnand HN12/P120ctn+PMA cell

2.2 PKC激活劑PMA對(duì)HN12/P120ctn細(xì)胞EMT的影響

用PMA處理HN12/P120ctn細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，隨著PKC表達(dá)的顯著降低，P120ctn、E-cad的mRNA(圖 2)和蛋白(圖 3)表達(dá)水平明顯升高，而其他EMT標(biāo)記物N-cad和Vim mRNA(圖 4)和蛋白(圖 5)表達(dá)水平顯著降低。

2.3 PKC激活劑PMA對(duì)HN12/P120ctn細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

HN12/P120ctn細(xì)胞加入PMA，檢測(cè)細(xì)胞遷移(圖 6)和侵襲(圖 7)能力的變化，Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HN12/P120ctn+PMA細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室微孔的數(shù)量顯著高于HN12/P120ctn；侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HN12/P120ctn+PMA顯著低高于HN12/P120ctn，因此，PMA對(duì)HN12/P120ctn細(xì)胞遷移和侵襲能力存在促進(jìn)作用(P<0.05)。

3 討 論

PKC存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，是由鈣活化的磷脂依賴性絲-蘇氨酸蛋白激酶，被激活后與胞膜內(nèi)壁結(jié)合作用于底物，能夠使底物蛋白分子內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生磷酸化。PKC與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，在OSCC細(xì)胞系TSCCA中，PKC的抑制劑staurosporine活化了細(xì)胞凋亡蛋白酶caspase-3[7]，降低了細(xì)胞遷移和侵襲的能力；此外，Lai等[8]也發(fā)現(xiàn)活化PKC途徑可以導(dǎo)致OSCC細(xì)胞遷移和侵襲，這些都提示PKC可能參與了OSCC的發(fā)生和發(fā)展。肝癌細(xì)胞系HepG2所處的酸性環(huán)境能夠誘導(dǎo)黏附連接中P120ctn的表達(dá)下調(diào)和絲氨酸去磷酸化，PKCα and δ基因敲除能夠阻斷這一過(guò)程的發(fā)生，提示PKC被激活后可能可以作用于在細(xì)胞膜表達(dá)的P120ctn，使P120ctn絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生去磷酸化[9,10]。

圖 2 PKC mRNA、P120ctnmRNA和E-cad mRNA在HN12/P120ctn和HN12/P120ctn+PMA處理后的細(xì)胞中的表達(dá) 圖 4 N-cad mRNA和Vim mRNA在HN12/P120ctn和HN12/P120ctn+PMA處理后的細(xì)胞中的表達(dá)

Fig 2 Expression of PKC mRNA, P120ctnmRNA and E-cad mRNA in HN12/P120ctnand HN12/P120ctn+PMA treated cells Fig 4 Expression of N-cad mRNA and Vim mRNA in HN12/P120ctnand HN12/P120ctn+PMA treated cells

圖 3 PKC、P120ctn和E-cad蛋白在HN12/P120ctn和HN12/P120ctn+PMA處理后的細(xì)胞中的表達(dá) 圖 5 N-cad和Vim蛋白在HN12/P120ctn和HN12/P120ctn+PMA處理后的細(xì)胞中的表達(dá)

Fig 3 Expression of PKC, P120ctnand E-cad protein in HN12/P120ctnand HN12/P120ctn+PMA treated cells Fig 5 Expression of N-cad and Vim protein in HN12/P120ctnand HN12/P120ctn+PMA treated cells

圖 6 PMA對(duì)HN12/P120ctn細(xì)胞遷移能力的影響

圖 7 PMA對(duì)HN12/P120ctn細(xì)胞侵襲能力的影響

P120ctn是連環(huán)蛋白家族的新成員，連環(huán)蛋白(catenin，ctn)是一個(gè)有相似結(jié)構(gòu)的胞內(nèi)糖蛋白家族，能與E-cad構(gòu)成連環(huán)蛋白-鈣黏蛋白復(fù)合體(cadherin catenin complex，CCC)，使E-cad被固定在細(xì)胞骨架上，與相鄰細(xì)胞形成穩(wěn)定的連接。P120ctn是唯一與E-cad胞內(nèi)肽段近膜端(juxtamembrane domain，JMD)結(jié)合的連環(huán)蛋白，參與聚集和穩(wěn)定細(xì)胞膜上的鈣黏蛋白，調(diào)控鈣黏蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間的黏附穩(wěn)定[11,12]。P120ctn與E-cad結(jié)合的關(guān)鍵部位便是磷酸化位點(diǎn)，P120ctn的磷酸化可能調(diào)節(jié)了鈣黏蛋白的結(jié)合和穩(wěn)定性[13,14]，從而影響CCC的穩(wěn)定性，在磷酸化降低時(shí)，細(xì)胞黏附能力會(huì)發(fā)生異常。越來(lái)越多的證據(jù)表明，P120ctn的絲/蘇氨酸磷酸化可能直接調(diào)節(jié)著P120ctn的功能[9]，并且PKC可能是一個(gè)重要的信號(hào)媒介。我們的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)PKC被PMA激活時(shí)，P120ctn高表達(dá)的HN12/P120ctn細(xì)胞中P120ctn和E-cad的表達(dá)隨之降低，提示在OSCC中PKC可能通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)了P120ctn和E-cad的表達(dá)。

EMT是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的主要因素之一，是指在某些特定的生理病理情況下，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞極性喪失，細(xì)胞黏附減弱，轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。鈣黏蛋白屬于黏蛋白家族，與膜轉(zhuǎn)移相關(guān)，是EMT的重要的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，是鈣依賴的具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞黏附分子[15]。E-cad是近年來(lái)研究較多的一種細(xì)胞黏附分子，它可能通過(guò)增強(qiáng)同型質(zhì)細(xì)胞間的黏附，使腫瘤細(xì)胞之間連接緊密，難以脫離原發(fā)部位進(jìn)入周圍的組織或血管，從而抑制轉(zhuǎn)移的發(fā)生。當(dāng)E-cad缺失時(shí)單個(gè)腫瘤細(xì)胞通過(guò)以下2 種方式之一運(yùn)動(dòng)遷移：間充質(zhì)樣細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(通過(guò)蛋白水解酶使腫瘤組織邊緣的單個(gè)細(xì)胞發(fā)生定向運(yùn)動(dòng))或阿米巴運(yùn)動(dòng)。后者通常表現(xiàn)為細(xì)胞極性缺失的非定向運(yùn)動(dòng)。與之相反，另一種鈣黏蛋白，N-鈣黏蛋白(N-cadherin，N-cad)在發(fā)生EMT時(shí)表達(dá)上調(diào)[16]，N-cad可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移，在三維環(huán)境中N-cad是調(diào)控細(xì)胞集體遷移的重要因素。波形蛋白(Vimentin，Vim)是EMT的另一個(gè)特征性標(biāo)記蛋白，正常表達(dá)于各種細(xì)胞類型中，在各種腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，包括前列腺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、惡性黑色素瘤和胃腸道腫瘤[17]。腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)與其他特異性蛋白改變包括能量代謝和信號(hào)傳導(dǎo)以及細(xì)胞骨架構(gòu)成和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)一致，在肝內(nèi)膽管癌[18]、SK-Hep-1肝癌細(xì)胞系[19]和胰腺導(dǎo)管癌[20]中Vim的表達(dá)水平與EMT的啟動(dòng)和高度惡性表型相關(guān)。Chaw[21]等對(duì)100 例口腔組織(包括正常組織、輕度異常增生、中重度異常增生和口腔鱗癌)的免疫組化研究表明，EMT標(biāo)記物的表達(dá)趨勢(shì)提示它們參與了口腔癌的發(fā)展，它們的異常表達(dá)是惡性轉(zhuǎn)化的潛在標(biāo)記物。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)PKC被激活時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)梭形細(xì)胞；除E-cad表達(dá)發(fā)生改變之外，其他EMT標(biāo)記物N-cad和Vim的表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)HN12/P120ctn細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著提高，提示在口腔鱗癌細(xì)胞系中PKC可能通過(guò)P120ctn參與了EMT，在腫瘤的遷移和侵襲中發(fā)揮了作用。這與前人在乳腺癌中的研究結(jié)果一致，在三陰乳腺癌中，P120ctn在S268絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化調(diào)節(jié)依賴于PKC ε，在一個(gè)PKCε激活的模型中，抑制PKCε將阻斷其向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化[22]，從而抑制EMT的發(fā)生。

綜上，我們推測(cè)，PKC可能通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)了P120ctn的表達(dá)，參與了細(xì)胞黏附的調(diào)控，促進(jìn)了EMT，在口腔鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮了作用。

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TheeffectsofPKCactivationontheepithelial-mesenchymaltransitionoforalsquamouscellcancercells

CHENZhong，ZHENGXiaodan，XUYong.

361008,DepartmentofStomatology,XiamenMedicalCollege,China

Objective： To study the effects of activating protein kinase C(PKC)on oral squamous-cell cancer(OSCC) cell epithelial-mesenchymal transition(EMT).MethodsPlasmid pCMV6-AC-GFP-P120ctnwas used to transfect HN12 cells to make P120-catenin(120ctn) overexpress and thereafter PKC activator PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) was added to the culture. Real-time fluorescent quantitative PCR and Western blot were adopted to test mRNA and protein expression of PKC, P120ctn, E-cadherin(E-cad), N-cadherin(N-cad) and Vimentin(Vim). Transwell cell invasion and cell migration assay were used to test the invasion and migration capacity before and after the activation.ResultsWhen PKC was activated by PMA, the expression of P120ctnand E-cad were decreased, the cell morphology changed, mRNA and protein expression of mesenchymal marker protein N-cad and Vim increased significantly. Meanwhile, the migration and invasion capacity of the tumor cells increased significantly(P<0.05).ConclusionIn OSCC cells, PKC may be involved in promoting EMT and the metastasis and invasion by adjusting P120ctn/E-cad expression and cell adhesion.

P120-catenin(P120ctn);ProteinkinaseC(PKC);Epithelial-mesenchymaltransition(EMT);Oralsquamous-cellcancer(OSCC)

廈門醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)基金(編號(hào)： Z2013-02)

361008， 廈門醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系

陳鐘 E-mail： 310571932@qq.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.022

(收稿： 2017-05-25 修回： 2017-07-18)