超敏蛋白BaPE1對煙草馬鈴薯Y病毒的誘導抗性

王 穎，付 強，陳雅寒，成巨龍，安德榮

(1.西北農林科技大學 植物保護學院，旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100；2.陜西省煙草公司 煙草研究所，西安 710061)

超敏蛋白BaPE1對煙草馬鈴薯Y病毒的誘導抗性

王 穎1，付 強1，陳雅寒1，成巨龍2，安德榮1

(1.西北農林科技大學 植物保護學院，旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100；2.陜西省煙草公司 煙草研究所，西安 710061)

為了探究超敏蛋白對煙草馬鈴薯Y病毒病的誘導抗性影響，采用半葉枯斑法和田間效果試驗研究超敏蛋白BaPE1提取物對枯斑三生煙和普通煙的誘導抗性和促生作用。結果表明，超敏蛋白BaPE1能誘導煙株對煙草馬鈴薯Y病毒產生抗性，并對煙草有一定的促生作用。接種前48 h噴施500 μg/mL超敏蛋白BaPE1預防效果達70.46%，接種后24 h、48 h噴施500 μg/mL超敏蛋白BaPE1治療效果達61.30%和60.59%,均顯著高于對照組；噴施500 μg/mL超敏蛋白后煙草在株高、莖圍、最大葉面積等方面表現出較好的生長勢，并高于其他處理。因此，超敏蛋白BaPE1不僅可以提高煙草抗性而且還能促進煙株生長、提高煙葉經濟效益。

超敏蛋白；煙草馬鈴薯Y病毒；抗性；促生

煙草馬鈴薯Y病毒病是由馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)引起的系統性病害，主要通過煙蚜介體傳播[1]。該病毒一般與煙草花葉病毒以及黃瓜花葉病毒等混合侵染，引起煙株花葉、斑駁、矮化、畸形、脈帶壞死等癥狀，嚴重影響煙葉的質量與產量，造成巨大的經濟損失[2]。目前，對于煙草病害的防治主要以化學農藥和使用抗病品種為主，成效甚微，且化學農藥的不合理使用造成的環境污染、農藥殘留以及抗藥性增加等問題日漸嚴重。生物防治作為符合現代農業可持續發展戰略的防治手段，得到越來越多人的關注。

1992年首次從梨火疫病原菌(Erwiniaamylovory)中分離得到超敏蛋白，之后國內外研究學者不斷從多種病原細菌中分離出具有相似功能的蛋白激發子[3-5]。超敏蛋白BaPE1是由解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Ba-168菌株產生的非特異性蛋白因子，屬于新型激活蛋白，具有誘導植物產生非寄主抗性和一定的促生作用[6-7]。本研究采用由解淀粉芽孢桿菌Ba-168菌株通過發酵得到的超敏蛋白BaPE1對煙草馬鈴薯Y病毒的誘導抗性進行研究，希望能夠為煙草病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料、供試菌株及相關培養基

煙草：心葉煙(Nitcotianaglutinosa)、普通煙 NC89(Nitcotianatobacumvar.NC89)，分別由中國農科院煙草研究所和陜西省煙草研究所提供。

菌株：解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Ba-168菌株，由西北農林科技大學植物病毒和資源微生物實驗室前工作者分離、鑒定并保藏。

供試病毒：煙草馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)，由西北農林科技大學植物保護學院植物病毒實驗室分離保存于(25±3) ℃防蟲溫室中普通煙草上。

試劑及儀器：w=20%嗎啉胍·乙銅(moroxydine hydrochloride-copper acetate，MCA)可濕性粉劑，青島瀚正益農生物科技有限公司；φ=8%寧南霉素(ningnanmycin)水劑，黑龍江強爾生化技術開發有限公司；手持式噴霧器，浙江廣豐塑業有限公司。

發酵用的培養基為Luria-Bertani培養基(LB)：酵母粉5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、H2O 1 000 mL、pH 7.2。

1.2 超敏蛋白BaPE1的制備

將解淀粉芽孢桿菌Ba-168菌株接種于LB平板上進行活化，28 ℃恒溫培養箱培養24 h。挑取適量菌株接種于50 mL LB液體培養基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min發酵培養72 h，從而制得超敏蛋白BaPE1發酵液。

將發酵液經4 ℃、10 000 r/min離心12 min后，將收集到的上清液通過0.45 μm的濾膜抽濾3～4次直至完全去除菌體，從而得到超敏蛋白BaPE1原液。

1.3 超敏蛋白BaPE1誘導心葉煙抗PVY作用

該部分包括預防試驗和治療試驗兩部分。預防試驗和治療試驗均采用半葉枯斑法測定，都選擇6～7葉期長勢一致的心葉煙，打頂后留3～4片葉，置于22～30 ℃溫室內自然光照培養1周，這兩部分試驗都選擇w=20%嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑和φ=8%寧南霉素水劑800倍液為對照藥劑。不同的是，預防試驗是將500倍稀釋處理的超敏蛋白BaPE1和800倍稀釋處理的w=20%嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑以及φ=8%寧南霉素水劑后采用噴霧法噴施到煙葉半葉，另半葉噴清水處理。于噴施處理24 、48 h后，對處理過的煙葉進行全葉片摩擦接種PVY。而治療效果是先將煙葉進行全葉片摩擦接種，保濕24 h、48 h后，分別將經過800倍稀釋處理的超敏蛋白BaPE1、w=20%嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑和φ=8%寧南霉素水劑噴施到接種的煙葉半葉，另外半葉采用清水處理。其他條件一致，每處理3株，每株處理3片葉，重復3次，之后置于22～30 ℃溫室內自然光照培養，7 d后統計枯斑數并計算預防效果和治療效果。

預防效果=(處理半葉枯斑數-對照半葉枯斑數)/對照半葉枯斑數×100%。

治療效果=(處理半葉枯斑數-對照半葉枯斑數)/對照半葉枯斑數×100%。

1.4 超敏蛋白BaPE1對煙草促生效果

于2015年陜西漢中西鄉縣試驗田進行，試驗分4個處理(超敏蛋白BaPE1，20%嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑，8%寧南霉素水劑和CK)，每處理3個小區，每個小區25 m2，大田面積667 m2，栽培行株距為120 cm×50 cm，每個小區種植不少于40株。在普通煙NC89的煙草苗床期進行噴藥處理，每次噴藥間隔20 d，共噴灑3次，3組處理均稀釋至800倍，快速均勻噴施于煙草莖葉上，各組噴施處理液以葉片上的溶液開始下滴為度。施藥時，小區間用塑料膜遮隔，以防小區間藥劑相互干擾。噴藥后于打頂后期對普通煙NC89的株高、莖圍、有效葉數、最大葉長和葉寬進行觀察。

1.5 數據分析

試驗數據采用SPSS 16.0軟件進行處理，采用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 超敏蛋白BaPE1誘導心葉煙抗PVY作用

試驗結果顯示，超敏蛋白BaPE1對于PVY具有較好的預防效果和一定的治療效果。相比于兩組藥劑對照組的抑制率，超敏蛋白對PVY的預防和治療效果具有明顯優勢。僅就超敏蛋白對PVY的預防效果來看，在接種前24、48 h噴施超敏蛋白BaPE1后的枯斑抑制率分別為53.01%和70.46%，說明越早噴施超敏蛋白BaPE1，對PVY的預防效果越好。從治療效果來看，超敏蛋白BaPE1可以有效地控制煙草馬鈴薯Y病毒的擴展和危害，防治效果在60%左右。相較于其他藥劑處理組的抑制率，超敏蛋白BaPE1的防治效果要好于藥劑處理組，說明接毒后及時噴施超敏蛋白BaPE1，仍然能夠提高煙草的抗性(表1、2)。

2.2 超敏蛋白BaPE1對煙草促生效果

小區促生調查結果顯示(表3)，噴施超敏蛋白BaPE1后，在打頂期煙草的株高、莖圍、最大葉面積均處于最高水平，且從高到低順序為超敏蛋白BaPE1>20%嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑>8%寧南霉素水劑>空白對照。噴施超敏蛋白BaPE1的植株表現出明顯的生長優勢，且葉片寬大、顏色變深，與20%嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑相比，株高、莖圍、最大葉面積分別提高15.09%、28.17%、9.47%。超敏蛋白BaPE1能夠有效地促進煙草生長，具有良好的促生效果。

3 結論與討論

本研究表明，經超敏蛋白BaPE1處理，可以有效控制PVY的擴展和對煙草的危害，誘導煙草對PVY產生抗性，并能夠在一定程度上對煙草有促生作用。調整超敏蛋白的噴施時間可以將枯斑抑制率從61.30%提高到70.46%，且都要比藥劑對照組的效果好，說明超敏蛋白能夠顯著提高煙草對PVY病毒的抗性。究其原因，可能是超敏蛋白BaPE1作為一種蛋白因子，通過激活植物自身免疫系統、生長系統等，從而達到提高植物抗性的效果[8-9]。一般藥劑對煙草抗PVY效果不佳，可能是長期使用化學藥劑導致植物產生的抗藥性從而影響植物對PVY的抗性[10]。通過研究超敏蛋白對煙草生長的影響，結果表明相比對照組，噴施超敏蛋白后的植株普遍表現出莖稈粗壯、葉片肥厚、葉片顏色濃綠，表現出更為旺盛的生長勢。對于噴施超敏蛋白所產生的促生作用，研究學者認為一方面是超敏蛋白作為蛋白因子本身所含有的氨基酸等物質直接作為植物生長所需營養成分；另一方面，超敏蛋白作為細菌發酵產物含有大量鐵、錳、鋅等營養元素，能夠促進植物合成更多的葉綠素等物質從而直接影響植物的蛋白質合成以及光合作用等[11-13]。

表1 超敏蛋白BaPE1對PVY的預防效果Table 1 Preventing effect of BaPE1 on PVY

注：數據為“平均數±標準誤”。同列數據后不同大、小寫字母分別表示經Duncan氏新復極差法檢驗在P<0.01、P<0.05水平差異顯著。下同。

Note:Data in the table are “mean±SE”.Different uppercase and lowercase letters in the same column indicate significant differences atP<0.01 andP<0.05 levels by Ducan’s new multiple test, respectively.The same below.

表2 超敏蛋白BaPE1對PVY的治療效果Table 2 Treatment effect of BaPE1 on PVY

表3 超敏蛋白BaPE1對煙草農藝性狀的影響Table 3 Effect of Harpin BaPE1 on NC-89 agronomic traits

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EffectsofHarpinBaPE1onPVY-resistantofTobacco

WANG Ying1,FU Qiang1,CHEN Yahan1,CHENG Julong2and AN Derong1

(1.State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, College of Plant Protection, Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China; 2.Tobacco Research of Shaanxi Province, Xi’an 710061,China)

In order to study effect of Harpin BaPE1 on induced-resistance on PVY, the half-leaf method and field experiment were selected to detect the anti-PVY activity and growth promoting effects of Harpin BaPE1 onNicotianatabacumvar.‘Samsun NN’ andN.tabacum.The results showed that the Harpin BaPE1 induced the tobacco got induced resistance and growth-promoting. Spraying 500 μg/mL Harpin 48 h before PVY inoculation, the prevention effect was up to 70.46%, and the treatment effect of 24 h,48 h after inoculation were 61.30% and 60.59%, and all the effects were significantly higher than the control. After spraying 500 μg/mL Harpin, the tobacco performed better growth potential in plant height, stem girth and area of maximum leaf, and higher than the other treatments. Therefore the Harpin BaPE1 not only could enhance the tobacco resistance of PVY, but also promote the growth.

Harpin BaPE1； PVY； Resistance； Growth-promoting

2016-09-26

2017-03-23

State Tobacco Monopoly Bureau“Aphidius Gifuensis Prevention and Control of Myzus Persicae Localization Technology Research and Extension”(No.KJ-2014-01).

WANG Ying, female,master student.Research area:plant pathology.E-mail:waktny@163.com

AN Derong,male,professor, Ph.D.Research area: plant pathology.E-mail:anderong323@163.com

S435.72

A

1004-1389(2017)10-1550-04

日期：2017-10-18

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171018.1733.038.html

2016-09-26

2017-03-23

陜西省煙草專賣局資助項目(KJ-2014-01)。

王 穎，女，碩士研究生，研究方向為植物病理。E-mail：waktny@163.com

安德榮，男，教授，從事植物病毒學研究。E-mail：anderong323@163.com

(責任編輯：郭柏壽Responsibleeditor:GUOBaishou)