生防菌SF1103、SF1104對黃瓜枯萎病菌的拮抗作用

趙文娟，付 博，徐升運，任 平

(陜西省生物農業研究所，陜西省酶工程技術研究中心，中國科學院 西北生物農業中心，西安 710600)

生防菌SF1103、SF1104對黃瓜枯萎病菌的拮抗作用

趙文娟，付 博，徐升運，任 平

(陜西省生物農業研究所，陜西省酶工程技術研究中心，中國科學院 西北生物農業中心，西安 710600)

為探明生防菌SF1103、SF1104對黃瓜枯萎病菌的拮抗作用，采用平板對峙法、菌絲混合及凹玻片孢子培養法研究其拮抗能力，采用特異平板培養法分析生防菌的產酶及次生代謝產物，并通過盆栽試驗分析其對生防菌的防效。結果表明，經2株生防菌發酵液處理的病原菌的菌絲與孢子形態發生嚴重畸形并停止發育；2株生防菌均能分泌高活力的蛋白酶與纖維素酶，此外，SF1103具有解磷作用，SF1104能分泌嗜鐵素；盆栽試驗表明，使用復合菌劑處理的出苗率較對照組提高23.3%，較化學防治組提高29.4%；發病率較無防治組下降25.9%，防效達到77.8%。生防菌SF1103、SF1104對黃瓜枯萎病菌具有較強的拮抗能力，不僅能有效防治黃瓜枯萎病，并且對黃瓜的出苗生長有促進作用，有望進一步開發為生防菌劑產品。

生防菌；黃瓜枯萎病菌；拮抗作用

黃瓜枯萎病是一種嚴重影響黃瓜產量與品質的土傳病害，在露地與保護地均可發生，特別是在保護地，特殊的環境條件與長期連作致使枯萎病的發病率更高，重發年份發病率可達80%～90%[1]?；瘜W防治是黃瓜枯萎病防治的重要手段，但因環境污染、食品安全等問題日益嚴峻，環保、綠色的生物防治技術得到各國政府的普遍關注。

芽胞桿菌屬的枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、蠟質芽胞桿菌(B.cereus)、解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)防治黃瓜枯萎病效果明顯，同時對黃瓜有明顯的促生和增產作用。近些年來，芽胞桿菌屬生防菌劑產品及生物有機肥的研發成為熱點，并已取得諸多研究成果，國內外也有相關商品登記和應用，但在實際應用中由于活菌制劑的田間定殖和抗藥等問題致使其抗病害性能大打折扣，也嚴重制約其在農業生產中的應用推廣。因此，不斷篩選拮抗能力強、抗病譜廣、環境抗逆性強、田間定殖能力強的拮抗菌仍是未來開發生防制劑的主要方向[2-3]。

為進一步明確解淀粉芽胞桿菌(SF1103)和枯草芽胞桿菌(SF1104)2株生防菌對黃瓜枯萎病菌的拮抗作用，以及兩者對黃瓜的協同增效防病和促生效果,本研究對這2株菌的拮抗性能、分泌的活性拮抗物質及盆栽育苗防效進行研究，以期為下一步生防菌制劑產品的產業化開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生防菌株：解淀粉芽胞桿菌SF1103和枯草芽胞桿菌SF1104，均分離自溫室黃瓜根際土壤。

病原菌：黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)，分離自溫室黃瓜田土壤，可引起黃瓜枯萎病。

培養基：PDA 培養基、PDA 培養液(為PDA不加瓊脂)；NA培養基、NB培養液(為NA不加瓊脂)。培養基配方參照《微生物學實驗》[4]。

黃瓜種子：‘新津雜2號’，山東寧陽縣良豐種業有限公司。

多菌靈(w=90%)：上海禾木藥業有限公司。

化學試劑：蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉等生物試劑均購自北京奧博星生物技術有限公司；磷酸二氫銨、羧甲基纖維素鈉、苯胺藍等分析純試劑均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防菌對黃瓜枯萎病菌的拮抗作用 抑菌對峙試驗[5]：采用平板對峙培養法，以病原菌為指示菌，將在PDA平板上生長良好的病原菌打成直徑6 mm的菌碟，將菌碟點接于新鮮PDA平板中央，同時將在試管內培養好的生防菌點接于距平板中央2.5 cm處的4個角點，以不接種生防菌為對照(CK)，30 ℃培養5 d后觀察并測量病原菌菌落直徑，計算SF1103和SF1104對病原菌的生長抑菌率，每處理重復3次。抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-6)×100%，式中單位為mm。

生防菌發酵液對黃瓜枯萎病菌菌絲形態發育的影響[6]：將黃瓜枯萎病菌菌碟(直徑6 mm)與生防菌用接種針挑一環一起接入50 mL PDA培養液，30 ℃、180 r/min 振蕩培養2 d，吸取少量培養液，顯微鏡下觀察真菌菌絲的生長情況。以不接生防菌的PDA培養液做對照，設置3 次重復。

生防菌的除菌體發酵濾液對黃瓜枯萎病菌孢子萌發的影響[5-7]：將待測生防菌接入100 mL NB 培養液，37 ℃、180 r/min搖床振蕩培養2 d 后，10 000 r/min離心20 min收集上清液，上清液再經0.22 μm微孔濾膜除去菌體，4 ℃冰箱保存，待用。病原菌培養5～7 d，待長出孢子，用無菌水洗制成孢子數密度3×108mL-1的懸浮液。取0.05 mL孢子懸液滴加入滅菌凹玻片，再加入等量生防菌除菌體發酵濾液，于滅菌平皿30 ℃保濕培養，隨時觀察孢子的萌發情況。對照為孢子懸液加入等量無菌水，各處理重復3 次。

1.2.2 生防菌活性代謝產物分析[8-9]蛋白酶活性檢測：將生防菌接在蛋白酶檢測平板(A：脫脂奶粉8 g溶于300 mL蒸餾水，115 ℃滅菌10 min，B：瓊脂8 g加蒸餾水定容至300 mL，121 ℃滅菌20 min，A 與B 分別滅菌后混合)，30 ℃培養3 d后觀察，產生清亮透明圈的視為能產生蛋白酶。

幾丁質酶活性檢測：將生防菌接種于以膠體狀幾丁質為唯一碳源的培養基(磷酸二氫銨1.0 g、氯化鉀0.2 g、水合硫酸鎂0.2 g、w=1%膠體狀幾丁質100 mL、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0)，30 ℃培養3 d，觀察有透明圈的則能產生幾丁質酶。

纖維素酶活性檢測：將生防菌接種至纖維素酶活性測定平板(蛋白胨10 g、酵母粉10 g、羧甲基纖維素鈉10 g、氯化鈉5 g、磷酸二氫鉀1 g、瓊脂18 g，pH 7.0)，30 ℃培養3 d 后用1 g/L剛果紅染1 h，倒掉染液，再用1 mol/L的NaCl浸泡1 h，倒掉，觀察有透明圈的則能產生纖維素酶。

β-1,3-葡聚糖酶活性檢測：將生防菌接種至苯胺藍葡聚糖瓊脂培養基平板(葡萄糖1.0 g、茯苓粉4.0 g、K2HPO41.0 g、Na2HPO43.0 g、苯胺藍0.06 g、FeSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂粉12 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5)，30 ℃培養3～5 d，觀察菌落周圍顏色變化，平板上產生無色水解透明圈的則能產生β-1,3-葡聚糖酶。

產吲哚乙酸活性檢測：將生防菌接入10 g/L胰蛋白胨水溶液(pH = 7.2～7.6) ，培養2 d 后加入3～4滴乙醚后再加入3～5 mL吲哚試劑[二甲氨基苯甲醛8 g溶于760 mL酒精(φ=95%)和160 mL濃鹽酸]，液面在乙醚與吲哚試劑間產生紅色環狀物者則證明能產生吲哚乙酸。

產嗜鐵素活性檢測：將生防菌接入產嗜鐵素活性測定平板[A溶液：60.5 mg鉻天青S溶于50 mL去離子水+ 10 mL三價鐵溶液(1 mmoL/L FeCl3·6H2O，10 mmoL/L鹽酸為溶劑)+72.9 mg CTAB溶于40 mL去離子水。上述3個溶液混合定容至100 mL，pH調至中性，121 ℃滅菌20 min。 B溶液：30.24 g Pipes 加入900 mL WA培養基，pH 6.8，121 ℃滅菌20 min。A、B液混合后倒入平板]，30 ℃培養3～5 d 后觀察，菌落周圍能產生橘黃色暈圈者則能產嗜鐵素。

解磷活性檢測：將生防菌接入解磷活性檢測培養平板[Ca3(PO4)24 g、葡萄糖10 g、酵母粉0.5 g、KCl 0.2 g、NaCl 0.2 g、(NH4)2SO40.5 g、MnSO40.03 g、MgSO4·7H2O 0.03 g、FeSO40.002 g、瓊脂20 g，定容至1 L，pH 7.0]，30 ℃培養3～5 d后觀察，有透明圈產生則表明該菌具有解磷作用。

1.2.3 盆栽育苗試驗檢測復合生防菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果[10]病原菌制備：將m(麥麩)∶m(水)=10∶6拌勻、燜料、使充分吸收水分制成麥麩培養基，500 mL三角瓶裝量200 g，121 ℃滅菌30 min，將培養好的黃瓜枯萎病菌塊接入此滅菌麥麩三角瓶，30 ℃培養7～10 d，待菌絲長滿長透后備用。

生防菌劑制備：分別將解淀粉芽胞桿菌SF1103與枯草芽胞桿菌SF1104接入NB培養基(500 mL三角瓶裝量200 mL)，37 ℃、180 r/min搖床培養48 h得到SF1103與SF1104生防菌劑；復合菌劑是將SF1103和SF1104 2種菌劑等質量混合均勻；單一與混合生防菌劑的有效活菌數均≥109cfu/mL。

黃瓜種子消毒：用50～55 ℃溫開水燙種消毒10 min，期間不斷攪拌以防燙傷，澇起瀝干備用。

黃瓜育苗土：從盛果期的桃樹園中取肥沃的表土做為試驗用土，去除石子、草根等雜物，過篩，121 ℃高壓滅菌1 h，晾涼，均勻拌入NH4H2PO4和(NH4)2SO4，兩者的添加量均為0.28 g/kg。

帶病土壤：將培養好的黃瓜枯萎病菌麥麩接種體掰細揉勻接入黃瓜育苗土，m(黃瓜枯萎病菌)∶m(育苗土)=1∶50，兩者攪拌混合均勻備用。

盆栽育苗試驗：于2016年3月11日播種，每個育苗盆裝土樣1 kg，每盆等距離播種3粒種子，每顆種子旁用牙簽標記位置，然后用清水將盆土澆透。對照組：用土為黃瓜育苗土，不添加病原菌，既不進行化學防治也不進行生物防治；處理1：用土為帶病土壤，既不進行化學防治也不進行生物防治；處理2、3、4：用土為帶病土壤。分別于播種后第3天和第9天用100倍生防菌液(原菌液稀釋100倍，有效活菌數107cfu/mL)進行灌種，每粒種子灌30 mL，播種后第33天用生防菌液(有效活菌數107cfu/mL)對出苗的黃瓜苗進行灌根與噴葉，每顆苗50 mL，其中處理2使用SF1103菌劑，處理3使用SF1104菌劑，處理4使用復合菌劑；處理5：用土為帶病土壤添加多菌靈，每10 kg土樣添加0.55 g。各處理按常規管理進行，例如根據土壤墑情用自來水進行灌溉，并適時進行松土。4月12日開始記錄出苗率與發病率。每處理重復3次。

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0軟件統計分析數據，采用新復極差法(Duncan’s法)進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 生防菌對黃瓜枯萎病菌的抑菌作用

平板對峙試驗結果顯示，生防菌SF1103、SF1104對黃瓜枯萎病菌的生長具有較強的抑制作用，病原菌與生防菌間出現明顯抑菌帶，SF1103與SF1104的抑菌率分別為70.9%和74.5%(表1)。

2.2 生防菌發酵液對黃瓜枯萎病菌菌絲形態發育的影響

解淀粉芽胞桿菌SF1103、枯草芽胞桿菌SF1104能明顯抑制黃瓜枯萎病菌菌絲的生長發育，且抑制效果顯著(圖1)，病原菌菌絲體出現畸形、斷裂，菌絲呈串珠狀膨大，膨大部位內部的原生質體大量凝聚成團，透過細胞壁，細胞內含物清晰可見，菌絲不再發育。

2.3 生防菌的除菌體發酵濾液對黃瓜枯萎病菌孢子萌發的作用

生防菌解淀粉芽胞桿菌SF1103與枯草芽胞桿菌SF1104的除菌體發酵濾液與病原菌孢子共培養后，病原菌的孢子出現嚴重畸形，孢子膨大變形成泡囊狀，孢子中出現空洞，無法形成正常的芽管和菌絲，生長發育停止(圖2)。推測，菌株SF1103、SF1104能產生胞外抑制黃瓜枯萎病菌孢子萌發的活性物質，對該活性產物的鑒定有待進一步研究。

2.4 生防菌SF1103與SF1104活性代謝產物的初步分析

分析生防菌解淀粉芽胞桿菌SF1103與枯草芽胞桿菌SF1104的產酶和產次生代謝物，發現SF1103能產生胞外蛋白酶與纖維素酶，其蛋白酶與纖維素酶的產酶系數(透明圈直徑/菌落直徑，記作d/D)分別達到5.6與2.7，產酶能力較強；具有解磷活性，但解磷能力較弱；不產幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶；在嗜鐵素檢測平板上無法生長，不產吲哚乙酸。SF1104同樣能產生胞外蛋白酶與纖維素酶，其蛋白酶與纖維素酶的產酶系數分別達到5.4與4.2，產酶能力較強；能產嗜鐵素，但產嗜鐵素的能力較弱；不產幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶；不具解磷活性，不產吲哚乙酸(表2，表3，圖3)。

表1 菌株SF1103與SF1104對黃瓜枯萎病菌菌絲生長的抑制作用Table 1 Inhibition of strain SF1103 and SF1104 aganist mycelial growth of Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum

注：d1、d2、d3均為重復測定值。

Note:d1,d2,d3were all repeated measured value.

A.SF1103；B.SF1104；C.CK

A.SF1103；B.SF1104；C.CK

2.5 盆栽育苗防效試驗

分析各處理的出苗率可知，處理4(施用復合菌劑的生防組)與其他5個試驗組間均有極顯著性差異，其出苗率(90.0%)比對照組(66.7%)提高23.3%，比處理1(無防治組60.0%)提高30.0%，比處理5(化學防治組60.6%)提高29.4%(表4)。處理2、3(施用單一菌劑的生防組)的出苗率與處理1和處理5間也有極顯著性差異，其出苗率均提高10%左右。

表2 菌株SF1103與SF1104產蛋白酶水平Table 2 Protease production levels of strain SF1103 and SF1104

注:d.透明圈直徑；D.菌落直徑。同表3.

Notes:d.Transparent circle diameter;D.Colony diameter.The same with table 3.

表3 菌株SF1103與SF1104產纖維素酶水平Table 3 Cellulase production levels of stain SF1103 and SF1104

A.蛋白酶 Protease；B.幾丁質酶 Chitinase；C.纖維素酶 Cellulase；D.β-1,3葡聚糖酶 β-1,3-glucanase；E.嗜鐵素 Siderophore；F.解磷活性 Acticity of decompose phosphorus；G.吲哚乙酸 IAA a.SF1103；b.SF1104

圖3菌株SF1103和SF1104產水解酶與次生代謝物的活性檢測
Fig.3ActivityofhydrolyticenzymesandsecondarymetabolitesproductiontestingofstrainSF1103andSF1104

分析各處理發病率可知，生防組與化學防治組的發病率均與處理1(無防治組)間存在顯著性差異，發病率大幅下降，施用復合菌劑的生防組下降25.9%，施用單一菌劑的生防組分別下降23.8%與24.2%。而施用復合菌劑的生防組與化學防治組的發病率間無顯著性差異。

表4 生防菌防治黃瓜枯萎病的盆栽防效Table 4 Control efficacy of bio-control bacteria on F.oxysporum f.sp.cucumerinum in potted test

注：數據為3次重復試驗的平均值。同列數據后不同小寫字母表示經Duncan’s法檢驗在P<0.05水平差異顯著。同列數據后不同大寫字母表示經Duncan’s法檢驗在P<0.01水平差異極顯著。

Notes:Data in the table are averages of three repeated tests.Different lowercase letters in the same column indicate significant difference atP<0.05 level by Duncan’s test.Different uppercase letters in the same column indicate significant difference atP<0.01 level by Duncan’s test.

分析盆栽防效可知，施用復合菌劑的生防組與化學防治組的防效間無顯著性差異，其防效達到77.8%，比化學防治組(85.0%)低7.3%；施用單一菌劑的生防組與化學防治組的防效間均有顯著性差異。

綜上所述，生防菌SF1103與SF1104能有效防治黃瓜枯萎病，并對黃瓜出苗有明顯促進作用；SF1103與SF1104的復合菌劑表現出比單一菌劑更優的防病與促生效果。

3 結 論

解淀粉芽胞桿菌與枯草芽胞桿菌是生防芽胞桿菌屬中被研究最廣泛并且被證實對多種植物病原菌具有抑制作用的2種芽胞桿菌，它們分泌的水解酶及次生代謝物是生防因子，與其生物防治效果密切相關[8]，目前，美國、德國、澳大利亞、日本及中國都已有其相關的生防活菌制劑產品進行登記并商品化生產[3]。

本試驗對2株防治黃瓜枯萎病的生防細菌，解淀粉芽胞桿菌(SF1103)和枯草芽胞桿菌(SF1104)進行深入研究，初步明確其拮抗方式：2株生防菌通過向胞外分泌高活力的蛋白酶與纖維素酶以及嗜鐵素致使病原菌的菌絲體出現畸形、斷裂，生長發育停止；致使病原菌孢子的原生質體凝聚形成顆粒和空洞，孢子嚴重畸形，生長發育停止，無法形成正常的芽管和菌絲。本研究結論與邢介帥等[5]、王芳等[8]、戴秀華等[11]、林東等[12]的研究結論均一致。

本研究顯示，施用SF1103與SF1104復合菌劑的生物防治組的出苗率為90.0%，較對照組提高23.3%，較無防治組提高30.0%，較化學防治組提高29.4%；發病率較無防治組下降25.9%，盆栽防效達到77.8%；另外，施用復合菌劑的盆栽防效高于兩個單一菌劑的防效，也說明SF1103與SF1104配合施用對黃瓜枯萎病的防治具有協同增效作用，這也與兩菌株能分別分泌嗜鐵素以及具有解磷活性相印證。綜上所述，生防菌SF1103與SF1104能有效防治黃瓜枯萎病，并且對黃瓜的出苗生長具有促進作用，具有深入研究的價值和農業推廣應用的潛力。

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AntagonismofBiocontrolBacteriaSF1103andSF1104onWiltPathogeninCucumber

ZHAO Wenjuan,FU Bo,XU Shengyun and REN Ping

(Biological Agriculture Institute of Shaanxi,Enzyme Engineering Research Center of Shaanxi Province,Northwest Biological Agriculture Center,Chinese Academy of Sciences,Xi’an 710600,China)

To understand the antagonism of SF1103 and SF1104 strains on wilt pathogen in cucumber,we studied the antagonism of the two strains onFusariumoxysporumf.sp.cucumerinumvia the plate confrontation test,the hyphae mixed cultivation test,and the test of spore cultivation using the concave slide method.We analyzed the ability of secrete enzymes and secondary metabolite of the two strains using specific plate culture method,and we also analyzed the control efficacy of the two strains onF.oxysporumf.sp.cucumerinumin potted test.The results showed that the hyphae and spores ofFusariumoxysporumf.sp.cucumerinumwere severely deformed and inhibited under the treatments of the two bacteria.Both of the two strains could produce protease and cellulose.The strain (SF1103) was able to decompose phosphorus,and the strain (SF1104) could produce siderophore.The results of control effect of the potted plant showed that the emergence rate of cucumbers under the treatment of the mixed biocontrol agents increased 23.3% and 29.4% higher than that of the blank control and chemical control,respectively.The morbidity of potted plants treated with biological control agents dropped 25.9% compared with non-control group,the control efficacy was 77.8%.SF1103 and SF1104 strains not only showed strong antagonism on wilt pathogen in cucumber,but also promoted the growth of germination.These strains could be exploited so as to become effective biological agents in the future.

Bio-control bacteria; Cucumber wilt; Antagonism

2017-01-12

2017-04-17

Shaanxi Agricultural Science and Technology Innovation Projects (No.2016NY-189); Xi’an Agricultural Science and Technology Innovation Projects [No.NC1314(1)].

ZHAO Wenjuan,female,associate researcher.Research area:applied microbiology.E-mail:myszhwj@126.com

S436.421.13；Q939.92

A

1004-1389(2017)10-1537-07

日期：2017-10-18

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171018.1733.034.html

2017-01-12

2017-04-17

陜西省農業科技創新計劃(2016NY-189)；西安市農業科技創新計劃[NC1314(1)]。

趙文娟，女，副研究員，研究方向為應用微生物。E-mail:myszhwj@126.com

徐升運，男，研究員，研究方向為生物肥料。E-mail:xshy1389@163.com

CorrespondingauthorXU Shengyun,male,research fellow.Research area:bio-fertilizer.E-mail:xshy1389@163.com

(責任編輯：郭柏壽Responsibleeditor:GUOBaishou)