淋巴細胞特有重組激活基因蛋白載體構建及功能鑒定

趙小惠，李 琛，張 華，鄭銘喆，季延紅 （西安交通大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院病原生物學和免疫學系，陜西西安710061）

淋巴細胞特有重組激活基因蛋白載體構建及功能鑒定

趙小惠，李 琛，張 華，鄭銘喆，季延紅 （西安交通大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院病原生物學和免疫學系，陜西西安710061）

目的：淋巴細胞特異性重組激活基因（RAG）蛋白1和2共同組成的RAG重組酶是造成淋巴細胞發(fā)育及產(chǎn)生抗體多樣性的關鍵性蛋白.本研究構建并優(yōu)化同時表達RAG1和RAG2的慢病毒載體，為研究RAG1和RAG2的結構和功能奠定基礎.方法：構建同時表達RAG1、RAG2和綠色熒光蛋白（GFP）的載體；Western Blotting驗證該載體RAG1和RAG2蛋白表達；體外重組實驗證實該載體表達的RAG蛋白具有催化斷裂DNA的功能.結果：構建了表達RAG重組酶的載體pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP；Western Blotting驗證了該載體表達RAG1和RAG2蛋白，并顯示該載體RAG1和RAG2蛋白的表達量具有較高的一致性.體外重組實驗證實該載體表達的RAG1和RAG2組成的重組酶具有更好的催化斷裂DNA的活性.結論：優(yōu)化后的pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體可以保證RAG1和RAG2同時有效表達，GFP可作為熒光標記，為后續(xù)細胞以及動物實驗奠定基礎.

載體優(yōu)化；重組激活基因蛋白；P2A序列；綠色熒光蛋白（GFP）

0 引言

哺乳動物免疫應答主要依賴于B或T淋巴細胞在發(fā)育過程中通過基因重排產(chǎn)生多樣性的免疫球蛋白（immunoglobulins，Igs）或T細胞受體（T?cell receptors，Tcrs）分子.Igs和Tcrs分別包括Igh、Igκ、Igλ和Tcrβ、Tcrα、Tcrδ、Tcrγ7個抗原受體基因位點.每個抗原受體基因在淋巴前體細胞或非淋巴細胞中以無翻譯表達蛋白功能的胚系基因片段簇形式存在，表現(xiàn)為每個基因位點的5'端含有多個可變區(qū)（varia?ble，V）和連接區(qū)（joining，J）基因片段，3'端含有數(shù)個恒定區(qū)（constant，C）基因片段.此外，Igh、Tcrβ和Tcrδ在V和J基因片段中間還含有多樣區(qū)（diversity，D）基因片段，V、D和J基因片段的重排過程稱為V（D）J重組［1］.這些特異性基因片段的V（D）J重組是由淋巴細胞特有的重組激活基因（recombination activating gene，RAG1和RAG2）編碼的重組激活基因蛋白（RAG1和RAG2）組成的RAG重組酶（后簡稱RAG），結合于V、D、J基因片段旁的重組信號序列（recombination signal sequence，RSS），催化基因片段和RSS之間的DNA斷裂.然后通過傳統(tǒng)的非同源末端連接途徑（non?ho?mologous end joining，NHEJ）將斷裂的基因片段組合在一起，形成編碼抗原受體可變區(qū)的基因，與編碼恒定區(qū)基因共同轉錄翻譯形成完整的Igs或Tcrs分子［2］.RSS是由5'端高度保守的回文結構——七聚體Heptamer（5'?CACAGTG?3'），3'端富含A/T堿基的九聚體Nonamer（5'?ACAAAAACC?3'）組成，和它們之間序列相對不保守，但長度固定在12 bp或23 bp空間間隔序列，把間隔序列長度為12 bp或23 bp的RSS分別稱為12RSS或23RSS.正常的V（D）J重組只發(fā)生在一個12RSS和一個23RSS之間，這種限制特點稱為12/23規(guī)則［3－4］.淋巴細胞特有的重排機制不僅對其發(fā)育和產(chǎn)生獲得性免疫應答起著決定性作用，而且V（D）J重組過程出現(xiàn)錯誤也可以促進淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生［2］.

小鼠全長RAG1（full length RAG1，fRAG1）含有1040個氨基酸，是重組酶必需的催化活性單位［5］.fRAG1從功能上分為兩部分，羧基端384?1008氨基酸為核心區(qū)（core RAG1，cRAG1），氨基端的1?383氨基酸為非核心區(qū)（non?core RAG1）［6－7］.390?448氨基酸區(qū)域稱為九聚體結合域（nonamer binding domain，NBD），能夠結合RSS的nonamer；528?760氨基酸區(qū)域能夠與RAG2相互作用并執(zhí)行RAG催化斷裂DNA的功能［8－9］.小鼠全長RAG2（full length RAG2，fRAG2）包括527個氨基酸，是RAG重組酶必需的輔助單位［10－13］.fRAG2在功能上也分為核心區(qū)和非核心區(qū)，氨基端的1?383氨基酸為核心區(qū)（core RAG2，cRAG2），羧基端384?527氨基酸為非核心區(qū)（non?core RAG2）［5］.盡管RAG2本身沒有直接結合DNA的活性，但可以與RAG1相互作用，增強RAG1結合DNA的親和力，是RAG催化斷裂DNA必不可少的單位［14］.RAG2的非核心區(qū)包含多個調控功能，非核心區(qū)的414?487氨基酸稱為植物同源結構域（plant homeodomain?finger，PHD?finger），能夠特異性地識別三甲基化修飾的組蛋白H3K4（H3K4me3），引導RAG2結合到活化的染色質區(qū)增強RAG的催化斷裂活性［15－18］.RAG2氨基酸序列的第490位的蘇氨酸（threonine，T）位點對于調節(jié)RAG2的穩(wěn)定性起著重要的作用.RAG2非核心區(qū)360?408富含酸性氨基酸，稱為酸性鉸鏈區(qū)（acidic hinge region），可以調控RAG介導的V（D）J重組DSB以c?NHEJ進行修復，起著維持基因組穩(wěn)定性的作用［19－21］.本研究通過構建同時表達RAG1和RAG2的慢病毒載體，并對其進行優(yōu)化，驗證它們的表達及功能，為進一步深入研究RAG1和RAG2的結構和功能奠定基礎.

1 材料和方法

1.1 材料pWPI?fRAG1、pWPI?fRAG2、pMSCV?P2A?Thy1.1、pWPI?IRES?GFP、pWPI?RAG1?IRES?RAG2質粒和重組載體pMX?Thy1.1均由本實驗室提供.293T細胞儲存于液氮中.RAG1、RAG2抗體由Schatz lab提供.FuGENE?6（Cat＃1814443，Roche）、抗hCD4抗體（Cat＃555347，abcam）、抗Thy1.1抗體（Cat＃561409，abcam）.PCR擴增引物見表1.

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 構建pMSCV?RAG2?P2A?Thy1.1載體 設計末端帶有BglII、NotI限制性酶切位點和能夠擴增全長RAG2的引物，以pWPI?fRAG2為模板，利用表1引物R2?BglII?L和R2?NotI?R按94℃、30 s，58℃、30 s，72℃、1 min，30 cycles的步驟PCR擴增并獲得全長RAG2，并利用BglII、NotI限制性核酸內(nèi)切酶消化全長RAG2片段及pMSCV?P2A?Thy1.1載體，通過T4連接酶將全長RAG2連接到pMSCV?P2A?Thy1.1上，利用表1引物R2?BglII?L、R2?NotI?R進一步進行菌液PCR、酶切鑒定陽性克隆并測序，獲得序列正確的pMSCV?RAG2?P2A?Thy1.1載體.

1.2.2 構建pMSCV?RAG2?P2A?RAG1?Thy1.1載體

設計末端帶有SalI、ClaI限制性酶切位點和能夠擴增全長RAG1的引物，以pWPI?fRAG1為模板，利用表1引物R1?SalI?L和R1?ClaI?R按照94℃、30 s，58℃、1 min，72℃、1 min，30 cycles的步驟進行PCR擴增并獲得全長RAG1，并利用SalI、ClaI限制性核酸內(nèi)切酶消化全長RAG1片段及pMSCV?RAG2?P2A?Thy1.1載體，通過T4連接酶將全長RAG1連接到pMSCV?RAG2?P2A?Thy1.1上，利用表1引物pMSCV?R1?R、R1?M?L，按照94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、1 min，30 cycles的步驟進一步進行菌液PCR、酶切鑒定陽性克隆并測序，獲得序列正確的pMSCV?RAG2?P2A?RAG1?Thy1.1載體.

1.2.3 構建pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體

設計末端帶有PacI、PmeI限制性酶切位點和能夠擴增全長RAG2?P2A?RAG1的引物，以pMSCV?RAG2?P2A?RAG1?Thy1.1為模板，利用表1引物pWPI?PacI?L、pWPI?PmeI?R，按照94℃、1 min，60℃、1 min，72℃、2 min，30 cycles的步驟PCR擴增并獲得全長RAG1，利用PacI、PmeI限制性核酸內(nèi)切酶消化全長RAG2?P2A?RAG1片段及pWPI?IRES?GFP載體，通過T4連接酶將全長RAG2?P2A?RAG1連接到pWPI?IRES?GFP上，利用表1引物R2?BglII?L、R2?M?R、按照94℃、30 s，58℃、30 s，72℃、1 min，30 cycles的步驟進一步進行菌液PCR、酶切鑒定陽性克隆并測序，獲得序列正確的pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體.

1.2.4 載體轉染293T細胞 用FuGENE?6轉染法將pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體轉染293T細胞，37℃培養(yǎng)72 h.

1.2.5 Western Blotting實驗 收集轉染后的293T細胞并提取蛋白，測定蛋白濃度，加入3×SDS，100℃變性10 min；配制分離膠（8%）和濃縮膠（4%），每孔上樣20 μg，電泳結束以后采用濕轉的方法進行轉膜，100 V恒壓轉PVDF膜，電流差達到250 mA停止轉膜.將膜置于5%牛奶封閉液中封閉，室溫下在搖床上孵育2 h.按照1∶1000稀釋RAG1、RAG2抗體，置于4℃搖床上孵育過夜；第二天用TBST洗膜3次，15 min/次；用5%牛奶稀釋二抗（1∶5000稀釋），室溫下在搖床上避光孵育45 min；用TBST洗膜3次，20 min/次；用ECL發(fā)光液進行顯影.

1.2.6 體外重組實驗 pWPI?RAG1?IRES?RAG2或pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體分別跟pMX?Thy1.1重組載體一起轉染293T細胞，72 h熒光顯微鏡下觀察GFP表達，隨后收集細胞.取1×106上述轉染的293T細胞，4℃，1500 rpm，離心5 min，棄上清，預冷1×PBS洗2次，100 μL預冷1×PBS重懸.每管加入5 μL hCD4抗體，2 μL Thy1.1抗體，4℃，避光，20 min，預冷1×PBS洗2次，500 μL預冷1×PBS重懸細胞，過濾，流式細胞儀檢測.

2 結果

2.1 構建pWPI-RAG2-P2A-RAG1-IRES-GFPPCR擴增帶有BglII，NotI限制性酶切位點的全長RAG2序列（圖1A）.用BglII，NotI限制性內(nèi)切酶消化全長RAG2的DNA以及pMSCV?P2A?Thy1.1載體，克隆形成pMSCV?RAG2?P2A?Thy1.1載體，利用引物R2?BglII?L和R2?NotI?R進行菌液PCR鑒定陽性克?。▓D1B），將陽性克隆提質粒后酶切并測序（圖1C）.PCR擴增帶有SalI，ClaI酶切位點的全長RAG1序列（圖1D），克隆形成pMSCV?RAG2?P2A?RAG1?Thy1.1載體，利用引物pMSCV?R1?R、R1?M?L進行菌液PCR鑒定陽性克隆（圖1E），將陽性克隆提質粒后酶切并測序（圖1F）.PCR擴增帶有PacI，PmeI限制性酶切位點的全長RAG2?P2A?RAG1序列（圖1G），用PacI，PmeI限制性內(nèi)切酶消化全長RAG2?P2A?RAG1的DNA以及pWPI?IRES?GFP載體，形成pW?PI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體，利用引物R2?BglII?L、R2?M?R進行菌液PCR，將陽性克隆提質粒后酶切并測序（圖1H、I）.

圖1 pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體構建過程

2.2 pWPI-RAG2-P2A-RAG1-IRES-GFP載體表達RAG1、RAG2和GFP成功構建pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體（圖2A），將其和實驗室原有的pWPI?RAG1?IRES?RAG2載體分別轉染293T細胞，72 h后收集細胞.流式細胞術顯示pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP表達GFP，效率為93%（圖2B）.提取細胞蛋白，蛋白定量后Western Blotting檢測RAG1和RAG2蛋白表達，顯示pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體兩種蛋白的表達量一致性高于PWPI?RAG1?IRES?RAG2載體（圖2C）.

圖2 pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體表達RAG1和RAG2

2.3 pWPI-RAG2-P2A-RAG1-IRES-GFP載體具有催化斷裂RSS的功能重組pMX?Thy1.1載體含有hCD4序列為標記基因，反義的Thy1.1的序列為報告基因，其兩端分別為12RSS和23RSS.RAG結合并斷裂pMX?Thy1.1載體12RSS和23RSS，通過NHEJ途徑把斷裂的DNA連接在一起，反義的Thy1.1序列倒置成正義序列，斷端被修復，載體即可表達Thy1.1（圖3A）.pWPI?RAG1?IRES?RAG2和pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP轉染293T細胞，pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP轉染后的細胞熒光顯微鏡下可觀察到GFP綠色熒光（圖3B）.驗證RAG重酶組的功能驗證時，流式結果顯示轉染pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體的293T細胞表達12.9%，pWPI?RAG1?IRES?RAG2載體表達7.9%.說明pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體表達重組酶的活性高于pWPI?RAG1?IRES?RAG2載體表達重組酶的活性（圖3C）.

3 討論

目前，慢病毒載體已經(jīng)被作為一種常用的基因表達工具，廣泛應用于基因治療等其他研究領域［22］.對于基礎研究者來說，設計并構建功能完整的慢病毒載體是進行后續(xù)基礎研究的基石.淋巴細胞發(fā)育過程中經(jīng)歷的基因重排對其發(fā)育和產(chǎn)生獲得性免疫起決定性作用，反之，這種基因的重排過程出現(xiàn)錯誤將導致淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生.介導重組的蛋白為RAG重組酶，由RAG1和RAG2共同組成.因此，建立RAG1和RAG2同時有效表達的載體對研究淋巴細胞發(fā)育和RAG異常表達造成淋巴系統(tǒng)惡性增殖性疾病至關重要.

內(nèi)部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）序列來源于腦心肌炎病毒，其被廣泛應用的原因如下.①位于IRES上下游基因可以同時表達；②促進核糖體結合在mRNA上，并促使不同位點的mRNA進行翻譯［23］.因此，IRES連接的兩個基因可以被同時轉錄并翻譯，使兩種蛋白同時表達.但研究發(fā)現(xiàn)含有IRES序列的載體其上下游基因表達水平不一致［24］.小RNA病毒如手足口病病毒和馬鼻炎病毒等含有特定的2A序列，研究證實2A肽段由18～22個氨基酸組成，其C末端序列高度保守，為?AspxGluxAsnProGlyPro?，這種肽段能在其C末端介導多聚蛋白的剪切，而剪切斷裂常發(fā)生在Gly?Pro殘基之間［25］.但2A肽剪切蛋白的功能并不通過蛋白水解酶作用，而是經(jīng)“核糖體跳躍”實現(xiàn)的［26］，研究認為2A肽改變了核糖體的活性，促進2A肽殘基Gly與tRNAGly之間的酯鏈水解，所以從轉錄復合物上釋放上游多肽的同時又推進了下游蛋白的翻譯，從而可以保證2A肽上下游蛋白同時表達.研究［27］表明2A肽上下游蛋白的同時有效表達可以避免IRES上下游蛋白表達不一致的缺點，所以本研究通過應用P2A這種2A肽構建表達重組激活基因蛋白的載體，并證實了P2A序列連接的RAG1與RAG2蛋白表達量一致性高于由IRES序列連接的RAG1與RAG2蛋白；在功能方面，含有P2A序列載體表達的RAG蛋白結合與斷裂DNA的活性也高于含有IRES序列的載體；而且pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體具有綠色熒光蛋白標記，對后期載體轉染細胞檢測轉染效率、分選等都提供了便利.

圖3 流式檢測Thy1.1表達量

本研究結果表明，優(yōu)化后的重組激活基因蛋白載體的兩種蛋白RAG1與RAG2表達效率高于實驗室原有的表達RAG重組酶的載體，同時也增強了RAG蛋白的功能，其帶有的綠色熒光蛋白也為載體提供了熒光標記，這為研究RAG重組酶對淋巴細胞發(fā)育及淋巴細胞惡性腫瘤的作用提供了更好的實驗基礎.

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Construction and functional identification of lymphocytes specific recombination activating gene protein vector

ZHAO Xiao-Hui，LI Chen，ZHANG Hua，ZHENG Ming-Zhe，JI Yan-Hong
Department of Pathogenic Biology and Immunology，School of Basic Medical Sciences，Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710061，China

AIM：To construct and optimize the vector expressing recombination activating gene（RAG）protein 1 and RAG protein 2 simultaneously and lay a solid foundation for studying the structure and function of RAG recombinase.METHODS：Vector expressing RAG1，RAG2 and green fluorescent protein（GFP）simultane?ously were constructed；The expression of RAG1 and RAG2 protein were identified by Western Blotting，then the function of RAG protein was detected by in vitro recombinant experiment.RESULTS：A recombinant vector expressing RAG recombinase was successfully constructed，and Western Blotting indicated that the expression level of RAG1 had a good consistency with the expres?sion of RAG2 protein in this vector.Vitro recombinant experiment suggested that pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP vector has a better DNA cleavage activity，and GFP reporter gene of the optimized pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFPvectorcould be used as cell labeling.CONCLUSION：After optimization，the RAG vector can ensure the expression of RAG1 and RAG2 at the same level effectively，and the reporter gene GFP can be used as a fluorescent marker and lays the foundation for further animal and cell experiments.

vector optimization；recombinant activated gene（RAG）protein；P2A sequence；GFP

R392.9

A

2017－08－11；接受日期：2017－08－26

國家自然科學基金面上項目（31170821，31370874，81670157）

趙小惠.碩士生.E?mail：18229016281＠163.com

季延紅.博士，教授，博導.研究方向：抗體多樣性機制.Tel：029?82655182 E?mail：jiyanhong＠xjtu.edu.cn

2095?6894（2017）10?21?05